黑曲霉所产α-L-鼠李糖苷酶制备普鲁宁

前期筛选得到一株产α-L-鼠李糖苷酶的黑曲霉,并利用该酶转化柚皮苷制备普鲁宁。该黑曲霉在以芦丁作为诱导剂的液体培养基中发酵72h,对发酵液用70%硫酸铵沉淀,透析得到α-L-鼠李糖苷酶的粗酶液。经优化该酶的最适转化温度为50℃,最适pH为5.0,在此条件柚皮苷转化2h后的转化率高达到97%以上。本研究可为α-L-鼠李糖苷酶用于制备普鲁宁这一类生物转化提供有效借鉴。     

一株产α-L-鼠李糖苷酶菌株的分析与鉴定

筛选得到了一株能够分泌α-L-鼠李糖苷酶的菌株。利用TLC和HPLC的方法,对芦丁的生物转化情况进行研究。结果表明,该菌株可以将芦丁降解形成槲皮素。测序结果表明该菌种具有α-L-鼠李糖苷酶基因。根据菌落形态学观察和分子生物学的18SrDNA基因序列分析及系统进化树分析,将该菌株初步鉴定为黑曲霉。更多还原     

微生物源α-L-鼠李糖苷酶制备橙皮素单葡萄糖苷

橙皮苷是一种黄酮类化合物,具有抗炎、抗氧化、抗癌、维持血管正常渗透压和降低血脂等多种生理活性。文献报道大多数天然产物中由于鼠李糖糖苷的存在,会降低了其生物利用率。从腐烂的柑橘中筛选得到一株α-L-鼠李糖苷酶的产生菌株,能将橙皮苷水解得到水溶性更好的橙皮素单葡萄糖苷。进一步对α-L-鼠李糖苷酶进行了分离纯化及酶学性质的研究。最后,采用大孔树脂法对橙皮素单葡萄糖苷进行了分离纯化,并对其洗脱工艺进行了研究,最后确定的工艺为30%的乙醇水溶液在1mL·min-1的流速下,可以有效的分离得到橙皮素单葡萄糖苷,其纯度达到87.55%。     

木薯MeSAD基因的电子克隆与生物信息学分析

Δ9-硬脂酰-ACP脱氢酶(stearoyl-acyl carrier protein delta 9-desaturase, SAD)是植物响应逆境胁迫的关键酶,在响应低温胁迫中发挥着重要的作用,克隆木薯(Manihot esculenta)SAD基因对抗寒机理及品种改良研究具有很大的理论意义和现实意义。本文以拟南芥(Arabidopsis thaliana)的SAD同源蛋白为探针,利用电子克隆技术,得到木薯SAD的cDNA,并对表达蛋白的一级至高级结构、结构域、基本理化性质及系统发育等进行生物信息学分析。结果表明,木薯SAD基因cDNA长度为1 685 bp,开放阅读框(ORF)为176～1 366 bp,编码396个氨基酸,主要包含α螺旋以及无规则卷曲序列。该蛋白主要定位在叶绿体基质内,包含酰基-ACP脱氢酶结构域,具有酸性和亲水性。系统进化分析显示,木薯与蓖麻(Ricinus communis)、巴西橡胶树(Hevea brasiliensis)和麻疯树(Jatropha curcas)等植物亲缘进化关系非常相近。本研究结果可为MeSAD基因功能解析、木薯抗寒机理及耐低温品种改良等奠定基础。     

扁穗冰草PLD基因cDNA序列克隆及生物信息学分析

利用RT-PCR技术和RACE方法克隆得到扁穗冰草(Agropyron cristatum(L.)Gaertn)PLD基因cDNA的全长,并对该cDNA序列、氨基酸序列的相似性、组成成分、理化性质、疏水性/亲水性、进化树、二级结构、三级结构、无序化特性进行了预测和分析.结果显示:扁穗冰草PLD基因具有2967个核苷酸,含有PLD所特有的HKD基序和C2结构域,属亲水性蛋白,二级结构以无规卷曲为主,蛋白质的三级结构显示两个HKD基序靠近形成具功能的活性位点,蛋白质无序化分析发现无序化区域较少;进化树分析表明与蒙古冰草亲缘关系最近,与草莓亲缘关系最远.为研究扁穗冰草PLD在干旱胁迫信号转导及应答过程的机理奠定基础.     

甜瓜抗病基因同源序列的克隆与分析

为了获得新的甜瓜抗病基因同源基因(RGA),我们根据NBS-LRR类抗病基因保守区设计兼并引物组合,以抗病甜瓜品种基因组DNA为模板进行PCR扩增,经筛选、分类与基因测序,获得7个甜瓜RGA序列,其中821与324两个RGA为本研究首次发现.将得到的序列与已知甜瓜RGA序列进行分析、比对,将重复的RGA合并,通过对不同RGA序列同源分析,发现甜瓜CC-NBS-LRR类与TIR-NBS-LRR类RGA的不同分布特征与不同RGA之间的相互关系,如MRGA10与MRGH5可能起源于同一基因.通过对RGA的遗传分析与比较基因组学分析,发现甜瓜RGA序列与抗病基因之间的对应关系,如抗枯萎病基因Fom-1和抗番木瓜环斑病基因Pry存在于nbs47-3(MRGH11)与MRGH21之间,其中候选抗病基因MRGH8推测为Fom-1;候选抗病基因MRGH9、MRGH10之一为Prv.     

黄鳝DEAD-box家族PL10基因的克隆与序列分析

通过PCR克隆的方法，从黄鳝(Monopterus albus)中得到两个PL10基因的cDNA片段Mo PL10A和Mo PL10B，长度均为1．127kb，推测其编码375个氨基酸的蛋白片段．结合其他PL10类同源物序列，对这两条cDNA进行了分析和初步的功能推测．根据此片段的氨基酸序列构建的系统发育树与形态分类结果一致．在不同组织中的RT—PCR结果表明Mo PL10A和Mo PL10B的mRNA在各组织中的分布有差异．     

青花菜抗坏血酸过氧化物酶基因BoAPX的克隆与表达分析

根据NCBI基因数据库提供的抗坏血酸过氧化物酶(Ascorbate Peroxidase,APX)基因序列设计简并引物,以青花菜(Brassica oleracea var.italica)叶片cDNA和DNA为材料进行PCR扩增,基因定名为BoAPX(Gen-Bank登录号:HQ871864).BoAPX的基因组全长为1 394bp,具7个内含子,编码区全长为753bp,编码250个氨基酸残基.序列分析结果表明,BoAPX的N端中没有信号肽序列,为胞质型APX,BoAPX与已知APX具有较高的同源性.RT-PCR结果表明,BoAPX的表达受霜霉菌(Hyaloperonospora parasitica)诱导,在96h时达最大值,说明BoAPX与霜霉菌抗性相关.以pBI121为植物表达载体,BoAPX为目的基因,成功构建了重组表达载体pBI121-BoAPX.     

半滑舌鳎DMRT 1基因的克隆与表达分析

利用同源克隆的方法克隆了半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)的DMRT 1基因;并用RT-PCR技术检测了该基因在半滑舌鳎不同发育时期以及雌雄成鱼的不同组织的表达情况.结果表明,该基因cDNA序列全长1 232 bp(GenBank登录号为EU007655),包括774 bp开放阅读框,131 bp5′非翻译区以及含poly(A)信号的329 bp的3′非翻译区,编码258个氨基酸.氨基酸序列同源性分析表明,半滑舌鳎DMRT1氨基酸序列与牙银汉鱼、黑鲷、青鳉、河豚和斑马鱼DMRT1氨基酸序列的同源性分别达到了63%、59%、54%、53%和52%;与光滑爪蟾、小鼠和人类的同源性较低分别为38%、42%和41%.RT-PCR分析表明,DMRT 1基因在半滑舌鳎早期胚胎不同发育时期和孵化后5、13、18、22和35 d的仔鱼均有表达,在孵化后22 d表达量最高.在成体鱼中只在雄性精巢中有特异表达,其他组织均无表达,表明该基因可能参与半滑舌鳎雄性性腺的发育或精子的形成.     

半滑舌鳎两种Aquaporinl同源基因的克隆与表达分析

克隆了半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)AQP1o和AQP1基因的全长cDNA序列,并对其序列和表达模式进行了分析.结果表明,AQP1o cDNA全长为993 bp,包括120 bp的5'非翻译区,789 bp的开放阅读框,84bp的3'非翻译区,编码262个氨基酸的蛋白质,分子质量为28.3×103.AQP1的cDNA全长为1 335 bp,包括63bp的5'非翻译区,786 bp的开发阅读框,486 bp的3'非翻译区,编码261个氨基酸的蛋白质,分子质量为27.4×103.聚类分析表明半滑舌鳎AQP1o蛋白与金头鲷和塞内加尔鳎等海洋鱼类在卵巢中特异表达的AQP1o聚为一类,而AQP1与非卵巢特异表达的AQP1聚为一类,表明该两类基因为不同类型的AQP1同源基因.RT-PCR分析表明两个基因具有不同的表达模式,AQP1o主要在卵巢中表达,提示其在卵巢中具有特定的生理功能、而AQP1则在雌雄鱼的多种组织中表达.     

青花菜抗病防卫基因BoSGT1的克隆、序列分析与诱导表达

SGT1参与了细胞周期、逆境反应、蛋白质泛素化和信号转导等过程,在植物抗病反应中起着重要作用.以青花菜(Brassica oleracea var.italica)为材料,克隆到SGT1基因,命名为BoSGT1,其基因组DNA和编码区全长分别为2 007和1 068bp,具有9个内含子;BoSGT1编码了355个氨基酸,编码蛋白含3个TPR、1个CS和1个SGS结构域.BoSGT1与14个SGT1的序列相似性为60%~87%,其中与拟南芥SGT1b的相似性最高;SGT1间的遗传距离为0.003~0.486,BoSGT1与血红老鹳草SGT1、拟南芥SGT1a及SGT1b聚为一组,与其他物种SGT1的关系相对较远,在进化树上处于不同分支.BoSGT1的表达受霜霉菌(Hyaloperonospora parasitica)和核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)的诱导,在霜霉菌侵染下,6,12和24h的表达量增加;在核盘菌诱导下,6,12,24和36h的表达量增加,暗示BoSGT1的表达与霜霉病及菌核病的抗病反应有关.BoSGT1的克隆和表达分析为进一步研究其功能奠定了基础.     

虹鳟腺苷酸转移酶基因2(ant2)cDNA克隆与蛋白结构分析

腺苷酸转移酶(ANT)是位于线粒体内膜上参与能量分子传导的转运蛋白,在细胞凋亡调控网络中发挥重要作用.以虹鳟鱼(Oncorhynchus mykiss)为研究材料,使用RT-PCR和RACE法分离和克隆了虹鳟鱼ant2基因cDNA的全长序列(GenBank登录号:FJ591153).该序列全长1276 bp,其中5'端非翻译区长66 bp,3'端非翻译区长316 bp,开放性阅读框长894 bp,编码297个氨基酸.该蛋白具有3个保守的线粒体穿膜功能结构域和3个转膜区.通过与其他脊椎动物腺苷酸转移酶蛋白序列的比较,发现该基因具有高度保守性,氨基酸序列的同源性均在90%左右.同源模建显示其与牛的线粒体ADP/ATP载体,chain A蛋白有相同的孔洞(cavity)结构.     

暗腹雪鸡细胞色素b基因的克隆及其在雉科中亲缘关系的分析

用聚合酶链式反应克隆暗腹雪鸡(Tetraogallus himalayensis)Cyt b基因,首次报道该基因的全长序列(1143bp AY678108),并与雉科中其他19个属的Cyt b基因进行同源性比较,分析了碱基组成和变异情况.用邻接法、最大简约法和最大拟然法构建了系统进化树,得到了基本相同的拓扑结构.结果表明雪鸡属与鹌鹑属、石鸡属的亲缘关系最近,形成单系群.雪鸡属与鹌鹑属的分歧时间为1.5～2.0百万年,与石鸡属分歧时间为1.7～2.4百万年.     

鲥鱼、太湖新银鱼和大银鱼18S rRNA基因的克隆与序列分析

本文利用多对引物,扩增并测定出鲥鱼、太湖新银鱼和大银鱼18S rRNA基因部分序列,其长度均为1206bp,其中太湖新银鱼与大银鱼基因序列完全相同.将3种经济鱼类与GenBank中10种脊椎动物及头索动物文昌鱼的18S rRNA基因同源序列进行比对分析,计算出序列碱基组成、序列间差异百分比和转换/颠换数值.基于18S rRNA基因序列,利用NJ法、ML法和BI法3种聚类方法,以文昌鱼为外群,构建13种脊椎动物的分子系统树,3种方法获得拓扑学结构一致的系统树.系统树包括3大支,一支为哺乳类、鸟类和爬行类共6个物种,一支为两栖类的2个物种,另一支为5种硬骨鱼类.结果表明:鸟类与哺乳类亲缘关系较近,而胡瓜鱼目与鲑形目亲缘关系近于鲱形目.此外,本文还讨论了脊椎动物18S rRNA基因的序列特征.