拟南芥AtTR1对AtCPK28和AtCPK32的体外泛素化修饰研究

为了研究E3连接酶AtTR1和非生物胁迫应答的相关蛋白AtCPK28、AtCPK32之间关系,本文构建原核表达载体pET28a-AtCPK28和pET28a-AtCPK32,并在大肠杆菌中表达了AtTR1、AtCPK28和AtCPK32重组蛋白,利用亲和层析纯化相应融合蛋白.将AtCPK28和AtCPK32蛋白分别加入含有ATP、泛素、E1、E2和AtTR1的体外泛素反应体系中,western blot检测到AtCPK28和AtCPK32有多聚泛素化条带,说明AtTR1在体外能多泛素化修饰AtCPK28和AtCPK32.结果表明AtCPK28和AtCPK32可能是AtTR1调控植物抗逆信号中的下游靶蛋白.     

过表达E3泛素连接酶ABRv1通过泛素化CPK3提高拟南芥干旱耐受

拟南芥基因ABRv1编码了一个E3泛素连接酶,其表达量受到干旱胁迫的诱导.为了探究ABRv1功能,我们构建了ABRv1的过表达株系并进行干旱处理,结果显示ABRv1过表达株系OE-3具有90.4%的存活率,ABRv1过表达株系OE-7有88.2%的存活率,野生型Col的存活率则为53.8%,而abrv1突变体仅有7.7%的存活率,说明过表达ABRv1提高了拟南芥对干旱的耐受能力.我们还测定了干旱处理下的失水率,也能得出与上述一致的结论.此外,我们使用纯化的GSTABRv1、His-CPK3蛋白进行了体外pull-down实验和体外泛素化实验,结果证明ABRv1能够和CPK3发生相互作用,ABRv1具有E3泛素连接酶活性并且能够把CPK3单泛素化.结果揭示了ABRv1作为一个正调控因子通过泛素化作用底物CPK3参与了拟南芥的干旱胁迫应答过程.     

水稻组蛋白单泛素化连接酶基因(OsHUB1)的克隆及其表达分析

对模式植物拟南芥的研究发现,AtHUB1基因参与调控植物对灰霉病的抗性.为了研究水稻的抗病机理,笔者利用同源搜索从水稻数据库中获得了目标基因的序列,并通过RT-PCR技术从水稻中克隆了组蛋白单泛素化连接酶基因,命名为OsHUB1.该片段包含1个2 655 bp的开放阅读框,编码了1个885氨基酸的多肽.与NCBI数据库的比对结果表明:OsHUB1的氨基酸序列与短柄草(Brachypodium distachyon)、葡萄(Vitis vinifera)、杨树(Populus tomentosa)、大豆(Glycine max)和拟南芥(Arabidopsis thaliana)的泛素E3连接酶的同源性分别为78%,68%,68%,67%和62%.这些不同来源的组蛋白单泛素化连接酶都含有一个高度保守的RING指结构域.半定量表达分析结果表明:OsHUB1基因能够被水杨酸(SA)和茉莉酸(JA)诱导表达,说明OsHUB1基因可能通过SA和JA介导的信号转导途径参与水稻的抗病反应.     

VMP1基因的克隆及其抗体的制备与鉴定

为了得到效价高、特异性强、能用于检测内源性VMP1蛋白的抗体，采用RT-PCR法，从L929细胞株中克隆鼠VMP1基因，重组入pCMVS载体，用PCR扩增与其氨基酸132-239区域对应的DNA片断，将该片段连接到原核表达载体pGST parallel中，在大肠杆菌BL21菌株中大量表达，经谷胱甘肽-琼脂糖树脂纯化后，得到高纯度的VMP1抗原．免疫新西兰兔，获得抗VMP1蛋白的兔抗血清，将血清纯化后即得到抗VMP1的多克隆抗体．用Western blot分析手段检测了该抗体的特异性及效价．在用该抗体检测外源性和内源性VMP1蛋白的试验中，证实该抗体效价高，特异性强，效果很理想．此方法可用于获得大量廉价的抗VMP1蛋白的高滴度和高特异性的抗体，为进一步研究VMP1在细胞内，尤其是在信号转导通路中的功能和作用奠定了基础．     

泛素与EB病毒核抗原1的融合表达载体的构建及表达

成功构建了EB病毒核抗原1(EBNA1)氨基端融合有泛素(ub iqu itin,Ub)的真核表达质粒pC I-Ub-EBNA1。间接免疫荧光分析表明,该重组质粒瞬时转染HeLa细胞后能有效表达。     

PMEPA1蛋白的原核表达、纯化及其抗体制备

为了从蛋白水平上检测前列腺跨膜蛋白PMEPA1(prostate transmembrane protain,androgen induced 1)在细胞内的表达和功能,构建了原核表达重组质粒pTrcHisA-PMEPA1和pGEX4T-2-PMEPA1,转化大肠杆菌BL21-RIPL后,IPTG诱导蛋白表达,分别用Ni-NTA和谷胱甘肽琼脂糖凝胶层析柱纯化蛋白。用His-PMEPA1免疫兔子制备抗体,并用GST-PMEPA1对抗体进行纯化。免疫印迹检测显示抗体能够特异识别细胞中内源PMEPA1蛋白。     

PD-1/PD-L1抗体阻断药物的研究进展与临床应用

研究发现在生理状况下PD-1与PD-L1相互识别能产生负向信号,该信号通路一旦被激活后,可诱导抗原特异性效应T细胞凋亡,该生理效应可防止过度免疫反应带来的附加损伤,因此该信号通路又被形象的称为“免疫刹车”.如果利用特异性阻断剂阻断PD-1/PD-L1信号通路,便可以恢复免疫细胞的杀伤抑制功能.截止至2019年12月,全...     

番茄SlSL1重组蛋白的表达、纯化及体外泛素化活性检测

泛素化作为真核生物细胞内普遍存在且极为关键的蛋白质翻译后修饰,可以使被修饰的蛋白质发生降解,在植物生长发育、胁迫应答等方面发挥着重要作用。泛素化降解需要通过E3泛素连接酶特异性识别靶蛋白并对其进行修饰,因此E3连接酶在泛素化途径中起着决定性的作用。文章通过克隆番茄SlSL1基因编码序列、构建原核重组表达质粒,并利用诱导表达、亲和吸附纯化SlSL1重组蛋白,以此进行SlSL1的体外泛素化活性检测。SDS-PAGE电泳和考马斯亮蓝染色结果显示,由所构建番茄SlSL1基因重组质粒纯化获得SlSL1蛋白;体外泛素化检测显示,SlSL1蛋白形成多聚化泛素条带,具有E3泛素连接酶活性,表明SlSL1可能在番茄的泛素化调控途径中发挥功能。     

拟南芥 BAH1 与大肠杆菌热胁迫耐受的关系分析

拟南芥BAH1含有保守的C3H4型RING结构域,与DnaJ锌指结构类似.利用原核表达纯化的BAH1进行体外泛素化实验证明了BAH1具有E3连接酶活性.然后通过表型回复实验发现BAH1融合J-domain结构域后(JdBAH1)和DnaJ一样能明显弥补danJ突变株MF634的热敏表型,在43℃存活;而转入突变锌指结构的JdBAH1C231S,C234S,C276S,C279S(JdBAH1△Zn1/2)菌株在43℃高温条件下不能存活,说明BAH1在大肠杆菌内具有类似DnaJ锌指结构的功能.因此,BAH1在E.coli中的功能有可能与DnaJ相似,通过锌指结构参与了DnaK/DnaJ伴侣系统发挥功能.     

利用泛素分裂系统筛选AtTR1相互作用蛋白质

以AtTR1作为诱饵蛋白利用泛素分裂系统在拟南芥cDNA文库中筛选与拟南芥AtTR1基因相互作用的蛋白质.运用营养缺陷型培养基和X-Gal显色、PCR扩增及酶切分析等实验排除假阳性,并对阳性克隆进行序列测定和比对.通过泛素分裂系统筛选到可靠的AtTR1相互作用蛋白质,测序比对后,选取HMA与AtTR1通过GST pull-down进行进一步的验证,结果证明它们确实存在相互作用,这对进一步研究AtTR1及其相互作用蛋白质在植物耐热中的作用和耐热分子机制奠定了基础.     

阿尔茨海默病PS-1基因突变的研究

采用聚合酶链反应及基因测序技术探讨阿尔茨海默病（Alzheimer病，AD）早老素-1（Presenilin-1，PS-1）基因第3、4、5、8外显子的突变特点，对13例散发性Alzheimer病（sporadic Alzheimer＇s disease，SAD）患者、12例血管性痴呆（vascular demendia，VD）患者及31名正常老年人的PS-1基因第3、4、5、8外显子片段进行扩增与序列分析．编号为SAD5的患者PS-1基因第3外显子扩增片段上存在1个缺失突变位点，编号为SAD3的患者PS-1基因第8外显子扩增片段的近3’端处发现2个插入突变位点．12例VD患者与31名正常老年人的PS-1基因第3、4、5、8外显子均未发现突变．实验结果表明，SAD患者PS-1基因中存在第3、第8外显子的突变．     

拟南芥 AtTR1 在盐胁迫应答中的功能初探

本研究主要探索油菜中E3泛素连接酶BnTR1在拟南芥中的同源基因AtTR1(At3g47550)的功能.通过体外泛素化实验证明AtTR1具有E3连接酶活性.基因表达分析显示该基因受200mmol/L NaCl显著诱导,说明该基因可能在响应盐胁迫中发挥一定的功能.为了更深入的探究该基因在植物耐盐中的作用,构建了植物表达载体pZH01-AtTR1转化突变体.在含有潮霉素的培养基上筛选阳性苗,并利用荧光定量PCR检测表明AtTR1基因已经成功转入突变体中.     

阿尔茨海默氏症分子病理学及治疗方法的研究进展

阿尔茨海默氏症是一种神经退行性疾病，是老年人的常见病、多发病，严重危害老年人的身心健康．近10年来，人们对其病因、病理进行了广泛的研究，认为自由基氧化胁迫和蛋白质的错误折叠是最基本的分子病理学机制，Aβ淀粉样沉积和tau蛋白引起的神经元纤维缠结是后的具体表现．综述了近10年对阿尔茨海默氏症的分子病理学研究进展及目前对其进行治疗的中西医方法．     

中药对阿尔兹海默症APP/PS1转基因小鼠的治疗作用研究进展

阿尔兹海默症(alzheimer’s disease,AD),是一种中枢神经系统退行性疾病,以老年斑块沉积和神经纤维缠结为主要特征,患者表现为认知能力减退、生活不能自理,该病的预防与治疗已经成为国内外研究的热点。在防治AD的实验研究领域,APP/PS1转基因小鼠模型有着广泛的应用,因为其能较好地反映阿尔兹海默症患者的病理特征、临床表现,是一种较理想的AD动物模型。本文综述近五年来中药对APP/PS1转基因AD小鼠治疗作用的研究进展,以期为后续防治AD的研究提供参考。     

Reduction of choline acetyltransferase activities in APP770 transgenic mice

Transgenic mice overexpressing the 770-amino acid isoform of human Alzheimer amyloid precursor protein exhibit extracellular b -amyloid deposits in brain regions including cerebral cortex and hippocampus, which are severely affected in Alzheimer's disease patients. Significant reduction in choline acetyltransferase (ChAT) activities has been observed in both cortical and hippocampal brain regions in the transgenic mice at the age of 10 months compared with the age-matched non-transgenic mice, but such changes have not been observed in any brain regions of the transgenic mice under the age of 5 months. These results suggest that deposition of b -amyloid can induce changes in the brain cholinergic system of the transgenic mice.