溶菌酶热变性的DSC研究

用差示扫描量热法研究了固体溶菌酶的热变性以及水溶液中不同变性剂与浓度对溶菌酶变性的影响. 结果表明, 溶剂水的存在及变性剂尿素和盐酸胍的加入使溶菌酶的变性温度降低, 变性焓减小; 同时, 在一定的浓度范围内, 溶菌酶的变性温度和变性焓随变性剂浓度的增大而降低. 盐酸胍的变性效果较尿素强, 这是由于盐酸胍与蛋白质分子间除了氢键作用外还存在着静电作用.     

盐酸胍和尿素诱导溶菌酶变性的微量热研究

应用恒温微量热技术,对盐酸胍和尿素与溶菌酶在30℃水溶液中的结合作用及造成溶菌酶变性的过程进行了研究,并根据简单结合模型,计算了它们之间的结合常数、结合自由能。用变性中点的直线外推方法求出了表观变性焓。实验结果表明,盐酸胍和尿素诱导溶菌酶变性的相互作用均分为3个阶段。溶菌酶在盐酸胍溶液中的变性焓在pH=4.16时为81...     

参数Z对疏水色谱中胍变蛋白质分子构象亦化的表征

用计量置换参数Ｚ对疏水色谱流动相中存在盐酸胍时蛋白质分子构象变化进行了表征。除溶菌酶外，其余４种蛋白质的Ｚ值随盐酸胍浓度的增大先增大，而后减小。蛋白质的Ｚ值随盐酸及脲浓度的增大，埋藏在蛋白质分子内     

胍变蛋白的构象变化及尺寸排阻色谱行为

 通过比较６种天然和变性蛋白的色谱行为，提出在不含盐酸胍的非变性体系中利用尺寸排阻色谱法研究蛋白质的构象变化。根据色谱峰数可以判断蛋白质变性时形成变体的数目；利用峰高可以描述蛋白质变性的完全程度；根据不同波长下峰高的变化可以推断蛋白质表面氨基酸残基暴露情况；利用保留时间可以比较各种变体相对体积的大小。     

胍变蛋白的构象变化及尺寸排阻色谱行为

通过比较６种天然和变性蛋白的色谱行为，提出在不含盐酸胍的非变性体系中利用尺寸排阻色谱法研究蛋白质的构象变化。根据色谱峰数可以判断蛋白质变性时形成变体的数目；利用峰高可以描述蛋白质变性的完全程度；根据不同波长下峰高的变化可以推断蛋白质表面氨基酸残基暴露情况；利用保留时间可以比较各种变体相对体积的大小。     

盐酸胍对疏水色谱中蛋白质保留行为的影响

研究了变性剂酸胍对几种蛋白质在高效疏水色谱中保留行为的影响，用液相色谱中溶质的计量置换保留模型和测流动相表面张力及蛋白质紫外吸收光谱方法研究的结果表明：在低浓度范围内，盐酸胍主要以疏水作用影响蛋白质的保留；而在高浓度区域内，盐酸胍的存在则显著影响蛋白质分子的构象，使其保留行为发生变化。     

溶液中金属盐对溶菌酶高级结构的影响

探索蛋白质结构稳定性及其淀粉样纤维化的环境条件具有重要意义.本文采用了荧光光谱法研究溶液中的金属盐对鸡卵清溶菌酶内源荧光和淀粉样纤维化的影响.结果表明,金属盐能够增加溶菌酶的热稳定性,减小淬灭剂对内源荧光的作用,对溶菌酶的高级结构具有一定的稳定作用.另一方面,在长时间热胁迫的情况下,金属盐可促进溶菌酶分子的聚集而纤维化.金属盐的这种双重作用分别与其阳离子和阴离子的性质有关.     

脲或盐酸胍溶液中变性溶菌酶复性过程中集聚体的研究

建立在蛋白质变性-复性三态模型的基础上, 给出了一个描述在变性液中变性蛋白质复性时蛋白质浓度和其复性率的关系式. 通过这个关系式, 可以获得两个重要的描述蛋白质变性-复性体系特征的参数, 一个是包含在一个集聚体分子中的变性蛋白质的分子数目n, 另一个是蛋白质从原始态到形成集聚体过程中的表观集聚平衡常数K. 以三种溶菌酶在脲和盐酸胍溶液中的变性-复性过程对此方程进行了验证, 结果表明所给出的方程能够很好地描述三种溶菌酶在这两种变性液中的复性结果, 三种溶菌酶在两种变性液中有形成二分子集聚体的趋势. 变性溶菌酶在复性过程中的电泳和高效凝胶排阻色谱也同时能够监测到复性过程中集聚体的形成, 并且监测结果与上述方程所得的结果一致.     

Lin光探针法研究不同变性剂对大肠杆菌石破天惊生磷酸酶构象的影响

通过监测大肠杆菌碱性磷酸酶（AP）的109位色氨酸（Trp-109）室温Lin光（RTP）的强度与寿命的变化，探讨了变性剂酸、盐酸及EDTA对AP构象变化的影响。结果表明：Lin光强度、Lin寿命与Trp-109所处的微环境刚性化程度有密切的关系。尤其是盐酸胍的加入，AP经历了曲型的3种变化状态：从稳定折叠态到中间态，最后形成展开态。极少量的EDTA加入，导致蛋白质变性、Lin光减弱和Lin光寿命缩短。     

非还原脲变性蛋白溶菌酶稀释复性过程中集聚现象的研究

用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳、阴极聚丙烯酰胺凝胶电泳和高效凝胶排阻色谱法, 研究了非还原脲变性蛋白溶菌酶在稀释复性过程中的集聚现象. 实验发现, 在整个稀释复性过程中, 没有蛋白溶菌酶集聚体沉淀产生. 当最终复性液中蛋白溶菌酶浓度小于4.0 mg/mL时, 复性过程中不会形成蛋白溶菌酶分子集聚体; 当最终复性液中蛋白溶菌酶浓度介于4.0～8.0 mg/mL时, 复性过程中会形成由非共价相互作用所引起的蛋白溶菌酶二分子和三分子集聚体; 而当最终复性液中蛋白溶菌酶浓度大于8.0 mg/mL时, 复性过程中除了会形成二分子和三分子蛋白溶菌酶集聚体外, 还会形成四分子蛋白溶菌酶集聚体. 在此基础上, 结合文献, 对非还原脲变性蛋白溶菌酶的稀释复性过程进行了描述.     

高效阳离子交换法分离纯化蛋清中的溶菌酶

 建立了用高效阳离子交换分离纯化蛋清中溶菌酶的新方法 ,讨论了纯化的工艺条件。蛋清样品匀浆后 ,用氯化钠初步纯化 ,然后用弱阳离子交换柱XIDACE WCX分离。结果表明 ,被纯化的溶菌酶和杂蛋白得到很好分离。经活性检测 ,溶菌酶过柱后的活性回收率为 10 7% ,蛋白的比活为 15 4 6 7U/mg ,纯化倍数提高了 5 6倍。用尺寸排阻 (SEC)鉴定 ,得到的溶菌酶呈均一性。该法较传统软基质低压离子交换分离速度快 ,纯化效率高。     

硅胶基质弱阳离子交换剂的合成及蛋清中溶菌酶的分离

用间接法合成了硅胶基质弱阳离子交换剂（ＸＩＤＡＣＥ－ＷＣＸ）,详细研究了合成填料的色谱性能,并与商品柱（Ｓｈｉｍ－Ｐａｃｋ ＷＣＸ－１和Ｐｏｌｙ ＣＡＴＡ）进行了比较。结果表明：合成柱比商品柱具有较高的分辨能力。通过考察合成填料的疏水性、蛋白质的保留值与等电点（ｐＩ）的关系、流动相的ｐＨ值和盐浓度对蛋白质保留行为的影响,论证了合成填料的离子交换特征。利用合成的色谱填料从蛋清中分离出纯度较高的溶菌酶     

脲和盐酸胍诱导溶菌酶去折叠的荧光相图法研究

用荧光相图法分别研究了脲和盐酸胍诱导卵清溶菌酶去抓叠的过程。当变性体 系中无还原剂2－巯基乙醇存在、脲浓度从0变化至4.0 mol/L（或盐酸胍浓度从0变 化至3.0 mol/L）时,溶菌酶从天然态转变为部分折叠中间态,当脲浓度从4.0 mol/L变化至8.0 mol/L（或盐酸胍浓度从3.0 mol/L变化至6.0 mol/L）时,溶菌 酶从中间态转变为去折叠态,此时该蛋白的变性过程符合“三态模型”。而当变性 体系中有该还原剂存在时,溶菌酶则由天然态直接转变为去折叠态,此时脲诱导该 蛋白去折叠的过程符合曲型的“二态模型”。实难结果表明荧光相图法可以检测蛋 白南去抓叠的中间态。     

用于变性蛋白质复性及同时纯化的简易型色谱柱的研制及其应用

研制出一种简易型色谱柱并通过装填大颗粒的疏水色谱填料对色谱柱的性能进行了考察,该柱的外形和操作如同传统的液相色谱柱,但它却在生物大分子分离方面有着和高效液相色谱相似的分辨率。另外,只要给该柱装填合适的固定相,比如疏水相互作用色谱固定相,便可用于蛋白质的复性及同时纯化。实验考察了该色谱柱的结构、操作和性能,包括柱压、柱寿命及对蛋白质的分辨率等。以溶菌酶为模型蛋白质,实验测得其在初始浓度为50.0 g/L时的质量回收率和活性回收率分别为(96.6±1.3)%和(101.1±6.0)%。这种简易型色谱柱价格低廉     

Study on Antibacterial Activity and Structure of Chemically Modified Lysozyme

Lysozyme is a natural protein with a good bacteriostatic effect, but its poor inhibition of Gram-negative bacteria limits its development potential as a natural preservative. Therefore, the modification of natural lysozyme to expand the antimicrobial spectrum become the focus of lysozyme study. Egg white lysozyme has low cost, rich content in nature, is easy to obtain, strong stability, and high enzyme activity, so it can be applied in the modification of lysozyme. Egg white lysozyme was modified by chemical methods using organic acids. Caffeic acid and p-coumaric acid in organic acids were used as modifiers, and 1-Ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride and N-hydroxy succinimide were used as dehydration condensation agents during modification. A certain degree of modified lysozyme was obtained through appropriate modification conditions. The antibacterial properties and structure of the obtained two organic acid-modified lysozymes were compared with natural enzymes. The results showed that compared with the native enzyme, the activity of modified lysozyme decreased, but the inhibitory effect on Gram-negative bacteria was enhanced. The minimum inhibitory concentrations of caffeic acid-modified enzyme and p-coumaric acid-modified enzyme on Escherichia coli and Pseudomonas aeruginosa were 0.5 mg/mL and 0.75 mg/mL, respectively. However, the antibacterial ability of modified lysozyme to Gram-positive bacteria was lower than that of the natural enzyme. The minimum inhibitory concentration of caffeic acid-modified enzyme and p-coumaric acid-modified enzyme to Staphylococcus aureus and Bacillus subtilis was 1.25 mg/mL. The peak fitting results of the amide-I band absorption peak in the infrared spectroscopy showed that the content of the secondary structure of the two modified enzymes obtained after modification was different from that of natural enzymes. In the study, two organic acids were used to modify egg white lysozyme, which enhanced the enzyme’s inhibition of Gram-negative bacteria, and analyzed the mechanisms for the change in the enzyme’s antibacterial ability from the perspective of the structural change of the modified enzyme, providing a new idea for lysozyme modification.     

盐酸胍诱导的变性卵清溶菌酶分子重折叠过程及其各稳定构象态的分布和过渡

采用变性和非变性电泳、 高效凝胶排阻色谱、 内源荧光发射光谱和荧光相图以及生物活性测定等方法, 研究了盐酸胍诱导的变性卵清溶菌酶分子的重折叠过程及此过程中卵清溶菌酶分子各稳定构象态的分布和过渡. 结果表明, 当复性液中盐酸胍浓度分别约为5.0和2.4 mol/L时, 变性卵清溶菌酶分子的重折叠过程各存在1个稳定折叠中间态, 重折叠过程符合"四态模型". 在卵清溶菌酶分子四态重折叠过程基础上, 结合盐酸胍与卵清溶菌酶分子之间的缔合-解离平衡, 给出了一个定量描述变性剂诱导的蛋白质分子复性过程中蛋白质分子复性率随溶液中变性剂浓度变化的方程. 该方程包含2个特征折叠参数, 一个是蛋白质分子从一个稳定构象态过渡到另一个稳定构象态的热力学过渡平衡常数k; 另一个是在此过程中平均每个蛋白质分子所结合的变性剂分子数目m. 通过这2个特征折叠参数能够定量描述盐酸胍诱导的变性卵清溶菌酶完全去折叠态、 折叠中间态和天然态分子随复性液中盐酸胍浓度变化的分布和过渡情况.     

Cooperative Effect of Guanidinium Chloride and Urea on Lysozyme Refolding

Abstract

The interaction between urea and guanidinium chloride (GuHCl) on lysozyme refolding was investigated in this work. Live micrococcus lysodeikticus was successfully introduced into a refolding system. Lysozyme can be refolded from the GuHCl-denatured, DTT-reduced state in a good yield of 96.54% at final protein concentration as high as 0.2 mg·mL^?1. A model could be employed to elucidate refolding kinetics behavior and the kinetics constants were studied. In the coexistence of GuHCl and urea, the aggregation rate decreased by increasing urea concentration to a proper value. The cooperation of GuHCl and urea not only suppressed the competition of the aggregation reaction but also increased the yield of refolding efficiently.     

脲和盐酸胍诱导的卵清溶菌酶分子去折叠过程中各稳定构象态的分布和过渡

以内源荧光光谱和荧光相图法研究了脲和盐酸胍诱导的卵清溶菌酶分子的去折叠过程,结果表明,当变性液中脲和盐酸胍的浓度分别约为4.0和3.0 mol/L时,卵清溶菌酶分子的去折叠过程均存在一个折叠中间态,这两个去折叠过程均符合"三态模型".在卵清溶菌酶分子"三态"去折叠过程的基础上,通过变性剂分子和卵清溶菌酶分子之间的缔合一...