遗传工程研究获得重大突破——化学合成基因使大肠杆菌生产脑激素

去年十一月二日,美国Riggs和Boyer等七人研究小组报告用化学方法合成的生长激素释放制抑因子(Somatostatin,以下缩写为som)的基因,已通过遗传工程技术重组,转移到大肠杆菌中,并且从这细菌的发酵液成功地获得了期望的脑激素——som,第一次用合成的基因创造了能生产脑激素的大肠杆菌。美国科学院院长Handler欢呼这是“科学上头等的大胜利”。在此以前,虽已有大量基因转移到大肠杆菌中,但是却没有一个能生产预先设计的蛋白质或多肽,例如去年夏天加州大学重组DNA的胰岛素小组报导:大鼠胰岛素基因转移进大肠杆菌已获得成功,但用此细菌生产胰岛素却没有成功。     

aprE基因表达的分子生物学和微量热法分析

利用分子生物学方法(SDS-PAGE和酶活检测法)未检测到所克隆的aprE基因在大肠杆菌中的表达产物(碱性蛋白酶), 而微量热法检测结果发现: 重组菌株的生长代谢产热曲线之间存在明显的差异. 根据这些差异, 分析了该基因的上、下游调控序列对该基因在大肠杆菌中表达的重要作用, 从而进一步对该基因进行了亚克隆, 得到了生物学方法可检测到的表达产物. 由此推测, 微量热技术有可能为检测外源基因表达及其调控, 以及为指导进一步基因工程操作提供一种新的快速灵敏的技术和方法.     

化学合成的亮氨酸脑啡肽基因在大肠杆菌中的克隆和表达

化学合成的亮氨酸脑啡肽(LEK)基因与质粒pBR322重组,转化大肠杆菌,经过原位杂交筛选,限制性图谱分析和Southern杂交鉴定,获得一批LEK基因重组体。插入乳糖操纵子(1ac)启动基因控制LEK基因的表达。一个lac转录方向和LEK基因转录方向相同的表达质粒,pLE103,能在大肠杆菌中产生LEK。用放射免疫分析方法检测,LEK的产量可达每毫克细菌蛋白426毫微克。     

霍乱弧菌无毒肠毒素A~-B~+基因在大肠杆菌的表达

应用DNA体外重组技术,成功地将霍乱弧菌毒素(CT)基因,在大肠杆菌中改建成CTA~-B~+基因克隆。组构的pMM-CTB重组质粒,在大肠杆菌中能高表达CTB亚单位,并能分泌到细胞外。     

小麦ACCase CT功能域基因在大肠杆菌中的表达及与除草剂的相互作用

以中国春小麦幼苗为材料,克隆构建了小麦质体乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)的羧基转移酶(CT)重组质粒( RCP18-5),并实现了重组质粒在大肠杆菌中的可溶性高表达.对重组蛋白的性质研究表明,该蛋白具有较强的疏水性,稳定性不高.为改善这种状况,对CT功能域基因进行了截短和延长,同样于大肠杆菌中进行表达.结果表明,仅长...     

用细菌合成人胰岛素链

这是用化学合成的人工基因在遗传工程研究中取得成功的第二个实例。实验设计的原理和步骤与第一个实例即生长激素释放抑制因子(Somatostatin)的完全相同(见本刊1978年第4期第147页):先用有机化学方法分别合成人工胰岛素的A链、B链的结构基因,然后用一系列DNA重组技术分别连接到大肠杆菌质粒上,这些质粒含有产生β-半乳糖苷酶的乳糖操纵子。当这些质粒转化至大肠杆菌以后,就可以使A、B链的结构基团都在乳糖操纵子调控系统下得到表达合成分别含有A链、B链的多肽分子,用溴化氰处理这些多肽链可以将A链、B链从β-台乳糖苷酶链上切除下来,A链、B链再分别纯化的。最后象我们在人工合成胰岛素工作中一样,将A链、B链通过二硫键联结成完整的胰岛素分子。迄今遗传工程在实际应用领域中所取得的这二个辉煌成果都是借助于有机合成的人工基因,这一事实对我们有机化学工作者是值得引起重视的。     

离子交换剂合成文摘

蒽和蒽醌结合聚氯乙烯的合成和某些性质及其离子交换树脂Biswas, Mukul; et al.,J. Appl. Polym. Sci., 1989, 38(9), 1641用α-蒽酚和蒽醌-2-酚的醚化反应将聚氯乙烯改性,由于PVC冷凝物不溶于所有一般的溶剂,因此通过元素分析和IR谱图来表征。随着外加频率(10～1.3×10~7Hz)增加到一个限定的常数值,这些冷凝物的介电常数和介质损耗迅速下降。将这些PVC冷凝物磺化得到了具有COOH和OH基团的弱酸树脂,但没有强的磺酸基。这大概是由于PVC骨架的氧化降解作用。[译自Chem. Abstr., 112, 78130t]     

[B10G1u,B24-Asp-B25]人胰岛素类似物的制备、鉴定与性质研究

采用PCR方法, 将人胰岛素分子B链B10位His突变为Glu, 在B24和B25位之间插入Asp, 构建了\胰岛素原基因. 利用通用型质粒pBV220构建表达载体, 在大肠杆菌DH5α中表达, 表达蛋白为包含体形式, 约占菌体总蛋白的20%～30%. 经过复性和凝胶过滤得到胰岛素原融合蛋白. 用胰蛋白酶和羧肽酶B酶切, 经DEAE离子交换和RP-HPLC纯化得胰岛素突变体类似物. 用凝胶过滤法测定了蛋白质分子自身的缔合性质, 用圆二色谱测定了构象变化. 放射性免疫活性及受体结合活性测定结果表明, 突变体分子缔合性明显下降, 放免活性和受体结合活性分别约为人胰岛素的73.6%和146%.     

天花粉蛋白基因的克隆、序列测定及在大肠杆菌和烟草中的表达

本文利用DNA多聚酶链式反应(PCR)技术,从括楼基因组DNA中扩增并克隆了天花粉蛋白基因,核苷酸序列分析结果表明,我们克隆的是天花粉蛋白的成熟肽及N端23个氨基酸的信号的编码序列,与前人从基因组或cDNA中克隆的该基因的比较发现,其同源性为99.25％,并且证实与发表的蛋白质一级结构的序列有较大差异,将该基因克隆到大肠杆菌高效表达质粒pJLA_(502)的P_RP_L启动子下游,通过温度诱导,得到了表达产物,进一步将该基因克隆到植物中间载体pE_3的花椰菜花叶病毒35S启动子下游,应用根癌农杆菌Ti质粒介导的遗传转化系统,成功地将该基因导入了烟草基因组,获得了转基因植株,Western blotting分析结果证实,天花粉蛋白基因已在大肠杆菌和转基因烟草中表达。     

[B10Glu,B24-Asp-B25]人胰岛素类似物的制备、鉴定与性质研究

采用PCR方法,将人胰岛素分子B链B10位His突变为Glu,在B24和B25位之间插入Asp,构建了[B10Glu,B24-Asp-B25]胰岛素原基因.利用通用型质粒pBV220构建表达载体,在大肠杆菌DH5α中表达,表达蛋白为包含体形式,约占菌体总蛋白的20%～30%.经过复性和凝胶过滤得到胰岛素原融合蛋白.用胰蛋白酶和羧肽酶B酶切,经DEAE离子交换和RP-HPLC纯化得胰岛素突变体类似物.用凝胶过滤法测定了蛋白质分子自身的缔合性质,用圆二色谱测定了构象变化.放射性免疫活性及受体结合活性测定结果表明,突变体分子缔合性明显下降,放免活性和受体结合活性分别约为人胰岛素的73.6%和146%.     

hKv4.3基因5′非翻译区序列S160功能分析

hKv4.3基因是形成瞬时外向钾电流Ito的主要分子基础,它在心脏和神经细胞中大量表达,但在其它组织中则未见大量表达.为了研究hKv4.3表达在基因水平的调节,将hKv4.3基因的5′非翻译区的一段序列( 2~ 160,称之为S160)克隆到报告质粒中,进行瞬时表达.发现S160对hKv4.3基因的启动子和SV40的启动子都有强烈的抑制作用,没有方向特异性,但却有位置特异性.经删除突变分析,在S160片段中发现了一个抑制元件S(GAGGGGTTAA),它位于hKv4.3基因中转录起始位点下游20~30bp处.在此基础上,用RT-PCR方法对mRNA进行定量分析,初步确认这个抑制元件对蛋白表达的抑制过程是在翻译水平上.     

Ti T—DNA基因在天仙子+烟草体细胞杂种培养细胞中的导入、表达及再生

携带章鱼碱型Ti质粒和胭脂碱型Ti质粒的根癌农杆菌不同菌株分别与天仙子+烟草体细胞杂种培养细胞经共培养离体转化程序后,Ti T-DNA基因在受体细胞中获得了转移与表达。虽然细菌处理对受体细胞的植板率具有一定的影响,但其激素自主型频率为33.9—76.8％,表现冠瘿碱合成酶活性的频率为9.7—47.5％。从转化细胞克隆再生的苗不易长大、难于生根,且其基部产生大量的次生瘤组织。在这种再生苗的叶组织及次生瘤组织中仍可检测到相应冠瘿碱合成酶的活性。     

HIV-1嵌合抗原的纯化及免疫原性分析

为获得高效的HIV诊断试剂,选定HIV-1的外膜蛋白env中469-511aa,538-674aa和700-734aa3处包含较多抗原位点的区域作为免疫抗原,用PCR的方法从HIV-1全基因扩增编码这3处片段的基因序列,将它们克隆到原核表达载体中,利用大肠杆菌表达系统表达嵌合蛋白.结果发现,3段嵌合基因能在大肠杆菌BL21(Star)中表达,通过Ni-sepharose4B金属Ni螯合层析柱分离纯化目的产物,酶联免疫检测结果表明,纯化抗原有较强的抗原特异性.     

人IL-16基因重组腺病毒载体的构建与鉴定

目的:构建并鉴定人白细胞介素16(IL-16)的重组腺病毒pAd-IL-16表达载体,为进一步研究IL-16功能奠定基础.方法:分离正常人外周血单个核细胞(PBMC),组胺刺激后提取总RNA,RT-PCR扩增IL-16基因,将其克隆到含有绿色荧光蛋白(GFP)标记的腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV后,再与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1共转化BJ5183细菌,获得重组腺病毒载体pAd-IL-16,转染 HEK 293T细胞包装病毒.荧光显微镜下观察细胞内绿色荧光,测定病毒效价,RT-PCR和Western blot分别分析细胞内IL-16 mRNA和蛋白质的表达.结果:经双酶切及基因鉴定,重组穿梭质粒和重组腺病毒质粒均见约400 by插人片段,测序结果和GenBank中的基因序列一致;重组病毒效价为2.8×10～8 pfu/mL;重组病毒感染后,HEK 293T细胞中IL-16mRNA和蛋白质均有表达.结论:成功构建IL-16重组腺病毒载体,并可在HEK 293T细胞中表达,为进一步研究IL-16的功能奠定了基础.     

新的有机化学反应

84001 [0]价钯催化烯丙基磷酸酯的烯丙基烷基化和胺化Tanigawa,Y.,Nishimura,K.,Kawasaki,A.,Murahashi,S.I.(Osaka Univ,Fac Engn Sci,Dept Chem,Osaka 560,Japan)Tetrahedron Lett.,1982,23(52),5549. 烯丙基二乙基磷酸酯(1)在[0]价钯催化下可容易地被丙二酸酯和胺所取代。这类反应的合成用途可连续胺化-胺化和烷基化-胺化,以(Z)-4-乙酰氧基丁烯-[2]-基二乙基磷酸酯(1b)为例说明。且产物有高的区域和立体选择性。     

hKv4.3基因5'非翻译区序列S160功能分析

hKv4.3基因是形成瞬时外向钾电流Ito的主要分子基础, 它在心脏和神经细胞中大量表达, 但在其它组织中则未见大量表达. 为了研究hKv4.3表达在基因水平的调节, 将hKv4.3基因的5'非翻译区的一段序列(+2~+160, 称之为S160)克隆到报告质粒中, 进行瞬时表达. 发现S160对hKv4.3基因的启动子和SV40的启动子都有强烈的抑制作用, 没有方向特异性, 但却有位置特异性. 经删除突变分析, 在S160片段中发现了一个抑制元件S(GAGGGGTTAA), 它位于hKv4.3基因中转录起始位点下游20-30 bp处. 在此基础上, 用RT-PCR方法对mRNA进行定量分析, 初步确认这个抑制元件对蛋白表达的抑制过程是在翻译水平上.     

基于气相色谱-质谱联用技术的高通量细胞表型分析方法

研究开发了一种基于96孔板培养和气相色谱-质谱联用(GC-MS)技术的高通量细胞表型分析方法。该方法分别以48种物质作为唯一能源对大肠杆菌进行培养,利用GC-MS研究野生型和yfcC基因改造大肠杆菌对各物质的分解代谢情况,实现高通量的细胞表型分析。结果显示,野生型和yfcC基因过表达大肠杆菌对14种物质的代谢能力有显著差异,yfcC基因过表达大肠杆菌对甘氨酸和柠檬酸的代谢能力明显强于野生型大肠杆菌,而对其他物质的代谢能力较弱,我们推测可能是由于yfcC基因促进乙醛酸代谢,导致yfcC过表达菌株对甘氨酸的代谢能力较强;野生型和yfcC基因敲除大肠杆菌间分解有显著差异的共16种物质,其中yfcC基因敲除大肠杆菌对丙氨酸、乳糖、肌醇和柠檬酸的代谢能力较强。该方法简单、高效,可以为未知基因功能研究提供更多代谢功能相关的参考数据。     

新型抗HIV-1蛋白GRFT的构建、表达及活性研究

根据已知的新型抗HIV-1蛋白GRFT基因氨基酸序列,推测其DNA编码序列,密码子优化及修饰后进行全基因化学合成,连接到原核表达载体pET28a（+）中,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,获得目的蛋白. SDS-PAGE、Western Blot分析结果表明,目的蛋白得到良好表达并具有抗原活性;对表达条件进行优化,在最佳表达条件下,目的蛋白的表达量可占菌体总蛋白的55.84%;利用Ni2+-NTA柱亲和层析法进行目的蛋白的复性和纯化,凝胶成像系统扫描分析表明,纯度可达94.06%;运用Dot-ELISA法进行复性蛋白的抗原结合活性检测,结果显示,目的蛋白能够与HIV-1膜蛋白抗原特异性结合,初步证明所表达的重组蛋白具有良好的体外结合活性;基于制备的能够表达HIV-1 gp120基因的靶细胞模型,运用IFA法开展目的蛋白的细胞结合活性研究,结果显示,目的蛋白能够与靶细胞发生特异性反应,表明成功制备并获得了具有生物活性的新型抗HIV-1蛋白GRFT,为进一步研制新型抗HIV-1基因工程药物及其靶向治疗制剂奠定了坚实基础.     

半合成人肿瘤坏死因子cDNA的构建及其在大肠杆菌中的高表达

本文报道从人基因文库中分离淋巴毒素(LT)基因的同时,克隆了肿瘤坏死因子(TNF)基因,这两个基因相距1.2kb.TNF基因有4个外显子,第4外显子编码TNF成熟蛋白157个氨基酸中的140个.将第4外显子切出一部分,再人工合成编码其余氨基酸的DNA片段,两者连接构成重组的人TNF(rhTNF)cDNA,并克隆在大肠杆菌表达载体中成功地得到表达.5 l罐发酵得菌体约20g/l,以L929为靶细胞测定细胞毒活性为10~6-10~7单位/ml.高压液相色谱仪分离纯化rhTNF,冻干后得白色粉剂.测定了这种rhTNF的氨基端的10个氨基酸序列,证明与天然的人TNF完全相同.纯度约为95％.     

志贺氏毒素B亚单位在大肠杆菌细胞表面表达的研究

本文通过寡核苷酸引导的定向诱变,将志贺氏毒素B亚单位的三个部分(Stx17B,Stx27B和StxB)融合至暴露在细菌表面的LamB蛋白的第153和154氨基酸之间的BamHⅠ位点。免疫印迹指出,B亚单位的三个部分作为与LamB的融合蛋白能在大肠杆菌中表达。间接免疫荧光和免疫电子显微镜分析表明:融合蛋白LamB/Stx17B和LamB/Stx27B能表达在大肠杆菌细胞表面,而融合蛋白LamB/StxB则不能在大肠杆菌表面表达,它聚集在细胞间质部分,对宿主细胞有毒性。将保护性抗原表达于细菌表面,这为构建预防志贺氏痢疾杆菌的菌苗后选株提供了一个新的途径。