低能离子注入介导的异常汉逊酵母菌基因组重复序列的突变研究

重复序列是真核生物基因组的重要组成部分,对生物的系统发育与进化、基因表达与调控有重要作用.为了进一步认识低能离子注入对酵母菌基因组结构的辐射效应,在全基因组de novo测序的基础上,本研究利用生物信息学方法,对低能离子注入前后异常汉逊酵母菌基因组中重复序列的突变特征进行了研究.在串联重复序列方面,离子注入导致异常汉逊酵母菌基因组中微卫星DNA序列和小卫星DNA序列的总长度分别缺失了147bp和5 487bp;多种类型的SSR的重复基序不仅发生了单碱基和多碱基突变,其数量和拷贝数也发生了不同程度的变化,其中优势三碱基重复基序AAC增加了2条,GAG和ATC分别突变为AGG和ATG,四碱基重复基序的GAAT和GTTG分别突变为GTTA和TTCA,五碱基和六碱基重复基序中分别有9种和28种发生了碱基突变;离子注入使高拷贝区的SSR数目增加了1倍,并导致重复单元为47bp和56bp的小卫星DNA序列缺失,同时新增了重复单元为35bp、58bp和59bp的三种小卫星DNA序列.在散在重复序列方面,离子注入导致LTR缺失5条、DNA转座子缺失19个、RC缺失1个,而LINE新增加12条,新增LINE总长度达1 568bp.研究结果为低能离子注入介导的酵母菌基因组突变与进化提供了分子证据,为异常汉逊酵母菌的分子育种和SSR分子标记的开发提供理论基础.     

丁型肝炎病毒(HDV)天然序列和G11C突变序列的转录折叠动力学研究

在转录折叠条件下,丁型肝炎病毒(HDV)的自剪切活性的发挥受到转录过程中形成的中间态结构、转录速率、突变位点等的影响.本文采用转录折叠动力学方法研究了HDV的天然(wild-type,wt)序列在不同转录速率下的转录折叠动力学行为,并分析了G11C突变对转录过程的影响.研究结果表明,虽然HDV的天然序列和G11C突变序列的转录折叠过程都存在快慢两条路径,但是对于HDV的天然序列,增大转录速率可以降低其慢速折叠路径上的RNA占据几率,而对于G11C突变序列,增大转录速率反而使得更多的RNA经过慢速路径形成天然态结构,并且在转录完全结束以后,HDV的天然序列要比G11C突变序列更快速地形成天然态结构.     

嗜麦芽菌素P28尾鞘基因启动子活性分析

嗜麦芽菌素P28是由嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)合成的细菌素,启动子Ps控制其主要结构基因(尾鞘基因和尾管基因)的转录.本研究首先用RACE方法确定嗜麦芽菌素P28的主要结构基因转录起始位点位于尾鞘基因翻译起始位点ATG上游47bp处的G碱基,然后以lacZ(β-半乳糖苷酶基因)为报告基因对201bp长的启动子Ps从5′端进行缺失突变,发现具有启动活性的最小启动子片段长度为55bp.当启动子片段截短为89bp时,启动子Ps-89活性不仅有明显升高,同时不受丝裂霉素C影响.扫描突变分析Ps-201启动子中124bp与89bp之间的碱基,结果显示,碱基序列-GTCTG-是Ps-201的关键调控序列,突变后活性提高了2.53倍.     

昆虫中RNA介导的转座因子

在昆虫中编码反转录酶的转座因子分为二大类：含长末端重复(LTRs)和不含长末端重复的转座因子.LTRs反转录转座子是具有两侧长正向重复末端序列的片段,中间部分序列包括一个或一个以上的ORFs(开放性阅读框架),其编码转座因子复制和转座所必需的蛋白质;包括Gypsy-Ty3家族、Copia-Ty1家族和Pao因子等.不含长末端重复的转座因子有时称为反转座子,能编码反转录酶但缺乏整合酶;包括I、F、G、Jockey、Doc和Het-A等因子.本文简介了有关昆虫基因组中转座因子的主要家族及近年来的研究     

江浙蝮蛇蛇毒蛋白C激活因子基因的克隆及测序

从江浙蝮蛇毒腺中抽提总RNA，RT－PCR进行体外扩增，获得江浙蝮蛇蛇毒蛋白C激活因子基因，克隆至pGEX-5X-3载体中，对3个重组克隆分别作DNA全序列分析，通过遗传密码推导出相应的氨基酸序列，与其它已知的丝氨酸复白酶蛇毒蛋白的氨基酸作比较，其中许多上氨基酸有很强的同源性，该基因的成功克隆，不仅推导出江浙蝮蛇蛇毒蛋白C激活因子的蛋白质序列，也为进一步开展江浙蝮蛇蛇毒蛋白C激活因子蛋白质工程的研究工作打下良好的基础。     

H9N2亚型禽流感病毒细胞适应株细胞致病性和HA、NA基因序列分析

对分离自中国南方的H9N2亚型禽流感病毒A/Chicken/Guangxi/KMⅢ/99(H9N2)进行了MDCK细胞的连续传代和NA基因序列的初步分析.研究发现,病毒接种细胞36 h左右出现细胞病变(CPE),细胞肿胀变圆,聚集,脱落.流感病毒经MDCK细胞连续传代19代后,HA效价与亲代病毒相当.将传代获得的第19代病毒进行基因克隆,与亲代病毒进行序列比较,发现经传代后其HA1羧基端的分子特征是:R-S-S-R,仍属于非低致病力毒株.     

人nov基因全长cDNA克隆、测序及其组织表达谱分析

采用特异性mRNA富集技术，从人早期胚胎中得到人nov基因(novH)的cDNA克隆，序列分析表明，该基因cDNA序列由2389个碱基对组成，包含一段长1071bp的开放阅读框(ORF)，3′端含有加尾信号AATAAA和ply(A)尾巴。Northern杂交显示，在Hela细胞和肾上腺组织中有表达的novHmRNA，大小约为2．5kb；多组织RNA点杂交分析结果进一步表明，novH基因在肾上腺和主动脉中的表达水平相对较高，在成人肾、肝、肺和小肠组织中亦有少量的表达。     

含缬氨酸-瓜氨酸肽的两亲性聚合物的胶束组装及其载药性能

以二肽缬氨酸-瓜氨酸(VC)为连接片段合成了一种可酶降解的两亲性聚合物硬脂酸-缬氨酸-瓜氨酸-对氨基苯基碳酸酯-聚乙二醇甲醚(C18-VC-PABC-mPEG).该聚合物在水环境下可自组装形成粒径分布均一的球形胶束,平均粒径约179nm.通过模拟溶酶体条件研究其酶降解行为及其负载抗癌药物阿霉素(DOX)胶束的释药行为,发现聚合物胶束在第7d时,平均粒径由179nm增大到约280nm,且粒径随着时间的延长进一步增加.同时,添加组织蛋白酶B(C_B)的载药胶束的释药量及释药速率均高于未添加C_B的载药胶束.此外,利用人类胰腺癌细胞株(BxPC-3)对聚合物载药胶束、空白胶束和未经负载的游离DOX进行细胞毒性实验,结果表明C_(18)-VCPABC-mPEG胶束几乎没有细胞毒性,且载药胶束的毒性明显低于游离DOX.     

VP-16诱导的鼻咽癌细胞亚系多药耐受表型的研究

经VP-16 大剂量短暂冲击加递增低浓度诱导方法建立了鼻咽癌耐药细胞亚系LCE/VP.用RT-PCR和FCM 免疫荧光法检测了耐药基因MRP和m dr1 在m RNA 水平和蛋白质水平的表达,并用MTT 法测定了LCE/VP对9 种化疗药物的敏感试验. 结果发现LCE/VP细胞MRP和m dr1 在m RNA水平均有表达,且前者明显高于后者,蛋白质水平的表达情况与m RNA 水平相一致;LCE/VP对9 种化疗药物中的6 种药物敏感程度均有不同倍数的增加. 这表明LCE/VP呈典型的MDR表型,并有耐药基因MRP和m dr1 的共表达,其中MRP起主要作用     

RNA碱基对的分子动力学模拟

RNA作为一种重要的生物大分子,其很多生物功能都与其结构有关.RNA碱基对的热力学性质和动力学性质是预测RNA结构的基础.本文采用全原子分子动力学方法模拟了RNA碱基对G—C在3种不同温度下的打开及闭合情况,统计分析了其打开和闭合几率.研究结果表明,随着温度的升高,碱基对G—C处于闭合状态的几率逐渐降低,处于打开状态的几率逐渐增加,而碱基对打开闭合状态的转换频率随着温度的升高而逐渐增加,并且形成碱基配对的3组原子间的氢键距离分布变宽.     

荷包红鲤自噬相关基因LC3B的克隆及在重金属镉胁迫下的表达

微管相关蛋白1轻链3(microtubule-associated protein 1light chain 3,LC3)是哺乳动物细胞中酵母自噬相关基因8(ATG8)的同源物,其LC3B亚型的表达强度与自噬泡数量的多少成正相关,为自噬发生的标志蛋白之一。应用RACE-PCR技术克隆了婺源荷包红鲤LC3B基因的cDNA全长序列,用RT-PCR方法检测了该基因在荷包红鲤主要组织中的表达,并用Real-time quantitative PCR方法检测了该基因在镉胁迫下转录水平的变化,以初步揭示该基因在镉胁迫下的作用。结果表明,荷包红鲤LC3B基因cDNA全长为2 138bp,其中开放阅读框长378bp,编码125个氨基酸,预测分子量为14.73kDa,等电点为8.76。序列比对显示,其编码的氨基酸序列和斑马鱼LC3B具有最高的一致性和相似性,并在系统发育树上聚为一支。该基因在荷包红鲤肌肉、脑、鳃、脾脏、肝脏、血液、头肾、肾脏和心脏组织中均有表达;在镉胁迫下,镉诱导显著影响了该基因在肾脏组织中的转录水平。LC3B基因参与的自噬反应可能参与了抗镉毒性作用。     

利用噬菌体展示技术制备识别酵母RNR_3原核表达片段的单链抗体

选取酵母细胞RNR_3蛋白序列中高保守片段:145-298位氨基酸序列,命名为RNR_3h进行原核表达.并利用噬菌体展示技术从非免疫小鼠噬菌体展示抗体库中淘选到能与该原核表达产物特异性结合的单链抗体.得到的3种单链抗体均识别原核表达片段的空间抗原位点.为寻找酵母RNR1和RNR_3的诱导表达水平与DNA损伤信号的相互关系,将真核生物RNRs发展为检测环境化学致痛物DNA损伤效应的生物标志物进行了尝试.     

伪狂犬病毒糖蛋白H基因片段的克隆、序列测定和分析

对伪狂犬病毒湖北地方株(PRVHB株)糖蛋白H基因片段进行了扩增、克隆、序列测定和分析,比较了该序列与PRVKa株及NIA-3株三者之间的同源性.结果显示,克隆片段长1396bp,G+c含量75.6%,包括糖蛋白H(gH)N端283个氨基酸编码区及上游调控序列和胸苷激酶(TK)C端136个氨基酸编码区.gH基因ORF上游调控区存在有TATA框和CAT框的真核启动子特征结构.PRVHB株gH基因片段序列与PRVKa株和N1A-3株相应序列的核苷酸同源性相同,为99.6%.推导的gH多肽N端第1～30位氨基酸组成的肽段富含疏水性氨基酸,具有真核信号肽的序列特征.     

虹鳟腺苷酸转移酶基因2(ant2)cDNA克隆与蛋白结构分析

腺苷酸转移酶(ANT)是位于线粒体内膜上参与能量分子传导的转运蛋白,在细胞凋亡调控网络中发挥重要作用.以虹鳟鱼(Oncorhynchus mykiss)为研究材料,使用RT-PCR和RACE法分离和克隆了虹鳟鱼ant2基因cDNA的全长序列(GenBank登录号:FJ591153).该序列全长1276 bp,其中5'端非翻译区长66 bp,3'端非翻译区长316 bp,开放性阅读框长894 bp,编码297个氨基酸.该蛋白具有3个保守的线粒体穿膜功能结构域和3个转膜区.通过与其他脊椎动物腺苷酸转移酶蛋白序列的比较,发现该基因具有高度保守性,氨基酸序列的同源性均在90%左右.同源模建显示其与牛的线粒体ADP/ATP载体,chain A蛋白有相同的孔洞(cavity)结构.     

罗氏沼虾幼苗体内一种极小病毒的序列测定与分析

从患罗氏沼虾幼苗肌肉白浊病的幼虾体内分离到两种病毒颗粒,诺达病毒(MrNV)和直径只有15nm的小病毒颗粒(extrasmallvirus,XSV),本文通过建立病毒cDNA文库获得XSV基因组的部分序列,在此基础上合成探针,用从病虾组织中提取的总PNA进行Northern杂交,结果表明XSV基因组至少包括两条RNA片段.利用不同的方法对XSV的两端序列进行克隆和测定,分别得到了872、831和662bp3个相互重叠的序列片段,这3个序列的阅读框编码一个相同的大小在17×103左右的蛋白.     

与HBV X蛋白相互作用的细胞蛋白的筛选及其鉴定

参考GenBank核苷酸序列库中的HBV的核苷酸序列设计合成了一对对应于HBx基因的引物，从原发性肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)患者的血清中提取HBV基因组DNA作为模板，扩增HBx编码区并测定了核苷酸序列．将该编码区克隆到酵母双杂交系统的诱饵蛋白表达载体pGBKT7中，转入酵母细胞AH109，进行表型鉴定．然后通过Mating实验从已制备好用于酵母双杂交系统的肝cDNA表达文库中筛选与HBx相互作用的细胞蛋白，并用体外免疫共沉淀实验进一步验证．研究表明，分离得到的与HBx基因编码的蛋白相互作用的4种新的细胞蛋白，分别是醛缩酶B、C8α亚基、一种丝氨酸蛋白酶Hepsin和一种未知蛋白．     

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS2在病毒包装中的作用

丙型肝炎病毒(HCV)是一种单股正链RNA病毒,是导致慢性肝炎的主要病原体之一.近年体外培养体系成功构建后HCV分子生物学的研究获得重要进展,HCV生活周期的各个步骤得到了深入研究.由于NS2蛋白既不是病毒粒子结构成分又不是病毒RNA复制必需成分,因此,近年有较多研究关注于NS2对病毒包装的影响.突变分析表明,NS2蛋白的N端保守位点及跨膜结构对病毒包装至关重要,C端蛋白酶蛋白酶结构域而非其蛋白酶活性为病毒包装所需.此外,NS2蛋白与病毒结构蛋白,非结构蛋白以及多种宿主因子存在相互作用,并在病毒包装过程中形成多种复合体,本文对这些研究进行了归纳总结.     

同源重组法构建枯草芽孢杆菌核黄素操纵子突变株

为了解除核黄素合成的反馈调节和提高核黄素的产量,以受体菌的核黄素操纵子为同源重组的指导序列,构建了整合表达载体pB1和pB2,通过双交叉同源重组的方法将线性化的pB1和pB2分别整合到受体菌的染色体上.构建了核黄素操纵子的rfn框和启动子ribPl被pB9启动子替换,并在ribB与ribA基因之间引入PnprE启动子的枯草芽孢杆菌核黄素操纵子突变株GJ04和GJ05.通过PCR方法验证了同源重组的正确性.基因工程菌遗传稳定.能分泌产生核黄素.发酵摇瓶实验结果表明:同源重组突变后的菌株GJ04和GJ05的核黄素产量明显高于具有玫瑰黄素抗性标记的菌株GJ02,发酵72 h分别提高了8.6%和11.2%.     

半胱胺修饰的FePt纳米颗粒对HeLa细胞的毒性

为探究半胱胺修饰的FePt纳米颗粒的抗肿瘤特性,本文采用化学还原法,制备出直径约3nm的FePt纳米颗粒,再用半胱胺(cysteamine,Cys)重新修饰其表面,将得到的FePt-Cys纳米颗粒分别与HELF(人胚肺成纤维细胞)和HeLa细胞(人宫颈癌细胞)孵育,用CCK-8法评估其细胞毒性,并通过流式细胞仪分析其对两种细胞周期分布的影响.结果发现,在一定浓度范围内,FePt-Cys纳米颗粒可以显著抑制HeLa细胞的增殖,但不影响HELF细胞的生长,其机制可能是通过细胞周期调节作用来产生细胞毒性.基于其对肿瘤细胞显著的杀伤作用和对正常细胞良好的生物相容性,FePt-Cys纳米颗粒将来可能作为一种有效的化疗药剂.     

柯萨奇病毒A组6型中国株的分子进化和时空传播分析

柯萨奇病毒A组6型(Coxsackievirus A6, CV-A6)是手足口病的主要病原体,可引起非典型手足口病和中枢神经系统疾病,对儿童造成严重的疾病负担,尚无上市的疫苗和抗病毒药物.基于3 288条CV-A6中国株VP1序列,利用Nextstrain平台的augur病原体生物信息分析包,构建了CV-A6的时间尺度分子进化树,确定了进化分支和分支突变,分析了分支突变与抗原表位之间的联系.进一步分析了CV-A6中国株各分支在中国七大地理区域的时空分布和优势分支,绘制了主要分支的时空传播路线.结果发现, CV-A6中国株主要分为B、C和D三个进化分支以及D2、D3a和D3b三个子分支,抗原表位处的突变形成了新的进化分支,促进了病毒的流行.华南和华东是CV-A6中国株的主要起源地,华南和华东相互输出、华东输出全国是中国株的主要传播模式.对CV-A6中国株的分子进化和时空传播分析,为CV-A6引起的手足口病等疫情的监测、预警和防控提供了重要支持.