Taura 综合征病毒主要结构蛋白的表达与纯化

根据Taura综合征病毒(TSV)基因组,设计特异性引物,从感染病毒组织中提取组织总RNA后扩增,分别将3个主要结构蛋白基因VP1、VP2和VP3克隆到pGEM TEasyVector.与表达载体连接后,导入大肠杆菌中诱导表达,并纯化目的蛋白.诱导表达的融合蛋白分子量分别为54.2×103、43×103和57.1×103,在变性条件下过柱纯化VP1和VP2,一次可以纯化10mg以上纯度较高的蛋白.     

黄颡鱼MyoD基因的克隆及其表达

采用RT-PCR和RACE(cDNA末端快速扩增)方法克隆黄颡鱼MyoD(myogenic differentiation antigen,成肌分化抗原)基因的cDNA全长序列,对其进行生物信息学和在雌雄个体组织中的表达差异分析.结果表明,黄颡鱼MyoD基因编码区由810个碱基组成,编码269个氨基酸,其中第1～89个氨基酸为Basic区,第90～141个氨基酸为bHLH结构;黄颡鱼的MyoD基因与斑点叉尾鮰的同源性最高为93%.在雌雄成体组织中的表达分析显示,雄性个体中肌肉和胃组织中的表达量极显著高于雌性个体(p<0.01),雌性个体的肾脏和鳃组织中的表达量显著高于雄性(p<0.05).通过MyoD基因在雌雄个体中表现出的组织表达差异,认为这可能是造成黄颡鱼雌雄生长差异的重要因素之一.     

一种水稻愈伤组织特异性启动子的克隆及其应用

筛选标记基因是一种用于植物遗传转化后阳性转化子筛选的有效手段,但目前介导标记基因表达均采用组成性启动子.这些启动子虽然在植物遗传转化得到了广泛应用,但由于是组成性表达,在转基因的生物安全性存在标记基因的安全性担忧.为了克服这一缺点,本文从水稻基因组内克隆了水稻半胱氨酸蛋白酶基因(Cyctein protease,CP)的启动子,通过gus转基因的验证,该启动子只在愈伤组织表达,不在水稻根、茎、叶等组织表达,为愈伤组织特异性表达启动子(Callus-specific Promoter,CSP).将该启动子用于介导筛选性标记基因的表达,通过对筛选性标记基因潮霉素磷酸转移酶基因(hpt)的密码子优化,明显提高了CP启动子在水稻转基因选择的转化效率,质粒转化效率和阳性植株率均达到了pCAMBIA1301的35S启动子介导标记基因hpt的选择效果.     

海滨锦葵早期盐胁迫应答基因表达

利用cDNA扩增片段长度多态性(cDNA amplified fragment length polymorphism,cDNA-AFLP)对盐胁迫下海滨锦葵早期根和叶片的基因差异表达进行了分析.结果表明,海滨锦葵早期盐胁迫应答基因的表达模式可以分为4类:抑制表达、重新诱导、上调表达和下调表达.对38个差异表达的盐胁迫应答基因片段进行了回收测序和BLASTX比对,其中34个差异表达片段与其他物种有高度同源性,4个差异表达片段为新基因片段.进一步对其中的6个差异表达基因的转录水平进行的实时RT-PCR相对定量分析,Avp1,Nhx1和Oat在根和叶中都上调表达;Gapdh和Pmp在根中下调表达而在叶中却上调表达;Chx1在根中上调表达而在叶中却下调表达.盐生植物海滨锦葵在盐胁迫的早期阶段可能通过细胞离子区域化以调节离子平衡外,还可能在整株水平上把钠离子区域化到根部.     

大豆种子形态建成期与成熟期正反抑制消减文库构建及差异表达基因分析

为了分析大豆种子形态建成期与成熟期基因差异表达情况,获得在发育过程中可能影响大豆种子形态建成及蛋白质、油脂合成代谢等调控的重要基因,利用抑制性消减杂交技术(suppression subtractive hybridization,SSH)构建了高含油量大豆品种中豆32开花后15天胚和36天胚正反消减文库.从正反消减文库中挑取克隆,经PCR及点杂交筛选后,从15天胚消减库(正向)和36天胚消减库(反向)中分别挑选了476个和471个有效克隆测序, 经BLAST比对归并后,根据测序结果设计基因特异引物,通过半定量PCR和荧光定量PCR检测了13个差异表达基因,其中正向库5个,反向库8个.对这些差异表达基因的组织特异性检测表明,仅发现4-662(蔗糖结合蛋白基因)在胚中特异表达.对这些基因在大豆种子发育过程中的作用进行了讨论.     

基于抑制消减杂交识别白化刺参和青刺参差异表达基因

为探寻刺参体色遗传的内在分子基础,运用Clontech SSH试剂盒分别构建了白化刺参和青刺参的正反向抑制性消减杂交文库;221个克隆测序分析确认了体色遗传差异性表达基因26个;GO分析显示这些差异基因分别隶属于核糖体基因、能量代谢、细胞结构、免疫调控、白化性状直接相关基因及未知基因.荧光定量PCR结果显示:ADP-核糖激化因子在白化刺参中相对表达量约是青刺参的2倍,而虾青素和小眼畸形转录因子在白化刺参中相对表达量则低于青刺参,分别为青刺参的0.38倍和0.47倍,相对表达量趋势和文库所得结果一致.该研究为进一步了解刺参体色分化及其优良性状的形成机制提供了基础资料.     

低盐协迫对大黄鱼gh、igf-1、hsp90和pparβ基因表达变化的影响

为了解大黄鱼在低盐胁迫下相关基因的表达变化, 采用实时荧光定量PCR技术检测了正常盐度25和降低盐度后3个节点(盐度8、盐度3和盐度1.5)鳃、肾、肝、心、脾、肌肉、脑和肠8组织中gh、igf-1、hsp90和pparβ基因mRNA的表达量变化. 研究表明: 低盐胁迫可显著影响大黄鱼中这4个基因的表达量. gh基因在盐度1.5节点除心脏外各组织中表达量均显著高于正常盐度(P<0.05), 其中脾的升幅最大; 盐度8和盐度3节点, 均是肝中gh表达量升高幅度最大, 分别为正常盐度的5.21和3.11倍. igf-1基因在盐度1.5节点除肌肉和脑外表达量均显著上调(P<0.05), 鳃中表达量最高, 为正常盐度的5.28倍, 其次为肾(3.05倍)和肝(2.20倍). hsp90基因在盐度8节点时心和肝中的表达量显著升高(P<0.05); 盐度1.5节点心中表达量显著降低(P<0.05), 而在其他组织中的表达量均显著升高(P<0.05). 在盐度8节点pparβ基因在心、肌肉、肝和脾中的表达量均显著高于其他3个盐度点(P<0.05); 盐度1.5节点鳃、脑、肾和肠中的表达量均显著升高(P<0.05), 分别为正常盐度时的9.04、7.36、3.39和3.19倍. 上述结果可为深入研究大黄鱼应对低渗环境的分子调控机制提供基础资料.     

人泡沫逆转录病毒介导的siRNA抑制HBV基因表达与复制

本研究采用基于PCR技术的siRNA表达方法,快速筛选到两个可以抑制HBV基因表达的siRNAs序列:S2和X1.S2和X1被克隆到人泡沫逆转录病毒(human foamy virus,HFV)载体中,构建成为分别表达S2和X1的单表达载体和同时表达S2和X1的双表达载体.将siRNAs表达载体转导入HepAD38细胞系中,多种检测分析的结果表明这些siRNA表达载体可以有效抑制多个HBV基因的表达和病毒DNA复制;并且其抑制作用是长期的,可以持续到转导后3个月.     

草鱼NF-κB2和IκBα基因的组织分布及对GCRV病毒感染的应答分析

NF-κB是具有多向性调节作用的蛋白质分子,NF-κB信号通路通过调控免疫相关基因的表达在鱼类先天性免疫中发挥重要作用,对该信号通路中2个关键信号分子NF-κB和IκB基因结构和表达模式研究非常重要。本文中,我们克隆了草鱼的NF-κB2和IκBα2个基因。氨基酸序列分析显示,NF-κB2含有1个RHD结构域、1个IPT结构域、6个ANKs结构域和1个Death结构域;IκB含有7个ANKs结构域。Real-time PCR分析发现,健康鱼体内NF-κB2在肝脏组织中表达量最高,IκBα在肾中表达量最高。GCRV病毒感染后,NF-κB2在肠中出现了显著的上调表达;IκBα在肝脏中产生了显著的下调表达,在肠中出现了小幅度的上调表达。说明NF-κB2和IκBα在病毒感染后的肝脏和肠中产生了主要的免疫应答,具体应答机制还有待进一步的研究。本研究结果为NF-κB2和IκBα在硬骨鱼类的抗病毒功能研究提供了重要线索。     

胃肠道恶性肿瘤及其切缘组织中c—myc基因mRNA和端粒酶活性的表达

探讨胃肠道恶性肿瘤及其切缘组织中c-myc基因mRNA和端粒酶活性表达与手术切缘的安全性关系。方法：用RT－PCR和TRAP方法检测12例胃癌和19例肠癌标本和切缘组织中c-myc基因mRNA和端粒酶活性的表达,结果：（1）胃肠道恶性肿瘤组织中c-myc基因mRNA和端粒酶活性有很高的表达率。（2）肿瘤的上下切缘组织中c-myc基因mRNA和端粒酶活性表达无明显差异。（3）在中心表达阳性的肿瘤中,距中心4厘 上端粒酶均为阴性表达,而c-myc基因mRNA在距4cm处仍有小部分呈阳性表达,5cm处则呈阴性,结论：就c-myc基因mRNA表达和端粒酶活性表达而言,距离肿瘤5cm可定为肿瘤的分子切缘。     

猪瘟病毒基因表达水平与同义密码子使用频率的关系

用信息类聚方法研究了猪瘟病毒基因表达水平与同义密码子使用频率的关系，求出了猪瘟病毒基因组各同义密码子的相对使用频率，得到了作为表征基因表达水平的各类基因的信息熵，所得结果与已有的研究结论相符．本研究表明：对于猪瘟病毒的单股正链RNA结构，同义密码子的使用频率对于基因表达水平有重要影响．     

慢性粒细胞白血病相关的癌基因、抑癌基因表达谱的研究

运用表达谱芯片技术对慢性粒细胞白血病相关的癌基因，抑癌基因表达谱进行研究，对慢性粒细胞白血病及正常对照细胞进行总RAN抽提，纯化后的mRNA进行逆转制备杂交探针，应用Biostar1024条人类全长基因cDNA芯片筛选与CML相关的基因，杂交信号用ScanArray5000扫描仪扫描，用ImaGene3.0软件分析，发现有9个癌基因、4个抑癌基因同时在慢性粒细胞白血病异常表达，分析这些异常基因表达谱，对进一步全面了解发病机制提供科学依据。     

普通小麦过氧化物酶特异表达与基因定位

利用普通小麦CS+H″和CS+R″异源染色体双体附加系对过氧化物酶的特异表达和基因定位进行了研究,结果初步表明:不同的过氧化物酶间具有一定的表达频率和表达顺序的差别,并具有一定的发育时期和组织器官特异性,染色体互作在过氧化物酶的特异表达过程中具有重要的遗传调控功能,其中在CS+H″系统中,P_x-e4基因位于2H、3H和5H染色体上,P_x-d3和P_x-b8基因位于5H染色体上,P_x-a1和P_x-a2基因位于3H、4H、6H和7H染色体上,P_x-e2基因位于5H染色体上,P_x-a3基因位于4H染色体上,P_x-d2基因位于1H、2H和6H染色体上,P_x-b10基因位于2H、3H和7H染色体上,P_x-c7基因位于1H和7H染色体上,P_x-d1基因位于1H、2H,3H、4H、6H和7H染色体上。     

细 胞 凋 亡 的 研 究 进 展

本文介绍了细胞凋亡的基因调控及最新研究进展 . 介绍 ced-3,ced-4, ced-9, p53, bc1-2, c-myc 基因在细胞凋亡中的调控作用 . 强调了氧化诱导、 Caspase-3在细胞凋亡中的重要作用 .     

LTB-hpaA融合基因原核表达产物的鉴定及其免疫保护作用

分别从幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)临床菌株Y06和大肠杆菌44851株DNA中扩增ltB和hpaA基因,构建ltB-hpaA融合基因及其原核表达系统,鉴定其表达产物的免疫原性、佐剂活性及其对Hp SS1株感染小鼠的保护作用.采用PCR分别从上述菌株DNA中扩增hpaA基因和ltB基因片段,构建ltB-hpaA融合基因,T-A克隆后测定核苷酸序列.采用质粒pQE32和宿主菌E.coli M15构建ltB-hpaA融合基因表达系统,并用不同浓度的IPTG诱导表达.采用western blot和GM1-ELISA鉴定表达产物的抗原性、免疫反应性和佐剂活性.建立HpSS1株感染BALB/c小鼠模型,检测rLTB-HpaA的免疫保护效果.采用ELISA检测125例胃、十二指肠粘膜活检标本尿素酶阳性患者血清中HpaA抗体和41株Hp临床菌株HpaA表达情况.与GenBank登录的相关序列比较,所构建的ltB-hpaA融合基因核苷酸序列同源性分别为94.25%～99.71%和95.38%～99.19%.所构建的表达系统pQE32-ltB-hpaA-M15的目的重组蛋白(rLTB-HpaA)表达量高达细菌总蛋白的1/3左右.rLTB-HpaA能与Hp全菌抗体发生结合反应,免疫家兔能产生特异性抗体.GM1-ELISA结果显示rLTB-HpaA能与牛GM1结合.rH-paA免疫小鼠的保护率仅为66.7%,rLTB-HpaA免疫小鼠的保护率可增至83.3%.81.6%患者血清(102/125)HpaA抗体检测结果阳性,所有菌株均含有HpaA.本文成功地构建了itB-hpaA融合基因高效原核表达系统,所表达的rLTB-HpaA有良好的免疫原性和佐剂活性,并对Hp感染小鼠有较强的免疫保护作用.     

ltB-ureB融合基因原核表达系统的构建及其产物免疫性和佐剂活性的鉴定

构建ltB-ureB融合基因原核表达系统并对其表达产物的免疫性和佐剂活性进行鉴定.采用PCR和T-A克隆法从幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)临床菌株Y06和大肠杆菌44851株DNA中获得了ureB和ltB全长基因扩增片段及其克隆,并构建了ltB-ureB融合基因及其原核表达系统pET32a-ltB-ureB-E.coli BL21DE3.在E.coli BL21DE3宿主菌中用不同浓度的IPTG诱导表达,并用Hp全菌抗体的Western blot、ELISA以及GM1ELISA分别证实了目的重组蛋白(rLTB-UreB)的免疫性和佐剂活性.与报道的相关序列比较,所克隆的ureB和ltB核苷酸序列同源性分别为96.88%～97.82%和99.12%～99.71%,氨基酸序列同源性为99.65%～99.82%和97.58%～99.19%.0.1～1.0 mmol/L的IPTG均能有效地诱导目的重组蛋白rLTB-UreB的表达,该蛋白主要以包涵体形式存在,其产量约为细菌总蛋白的35%.Western blot结果证实rLTB-UreB不仅能与商品化的Hp全菌抗体结合,免疫家兔后也能产生特异性抗体,表明rLTB-UreB有良好的免疫反应性及抗原性.GM1-ELISA结果显示rLTB-UreB能与牛GM1结合,表明rLTB-UreB有佐剂活性.以兔抗rLTB-UreB为一抗,发现所检测的109株Hp临床分离菌株均表达UreB;以rLTB-UreB为包被抗原,发现所检测的125例Hp感染者血清中均存在UreB抗体;表明UreB广泛存在于不同的Hp菌株中,并有很强的抗原性,也提示rLTB-UreB确有自然表达UreB的抗原特异性.本文成功地构建了LTB-UreB融合基因原核高效表达系统,所表达的LTB-UreB融合蛋白有良好的免疫性和佐剂活性,为Hp基因工程疫苗的产业化奠定了坚实的基础.     

稀有鮈鲫（Rare gudgeon）Sox基因的克隆及序列分析

根据人的SRY基因中HMG-box保守区设计引物，采用PCR技术在稀有鮈鲫雌雄个体基因组DNA中分别扩增，发现3个大小分别为220、700和1500bp的片段，经过克隆和测序分析，从220bp的片段中获得两个基因片段，证明为稀有鮈鲫的Sox1和Sox21基因片段，无性别差异，其DNA序列与人及斑马鱼相应Sox基因相似性分别为Sox1：80．4％和97％；Sox21：77．3％和9l％，其编码的氨基酸序列与人及斑马鱼相应SOX蛋白相似性分别为Sox：96％和98％；Sox21：88％和100％，显示了其高度的保守性．此外，从GenBank、MEBL和DDBJ数据库获得了92个已克降的物种SRY和Sox基因全长核苷酸编码序列及HMG保守区序列数据．通过对这些数据进行序列比对及策类树的构建，分析了Sox基因家族成员的分类及分子进化模式，对稀有鮈鲫的性别决定进行了探讨，为Sox基因的进化研究提供分子基础．