参数Z对疏水色谱中胍变蛋白质分子构象变化的表征

用计量置换参数Ｚ对疏水色谱流动相中存在盐酸胍时蛋白质分子构象变化进行了表征。除溶菌酶外，其余４种蛋白质的Ｚ值随盐酸胍浓度的增大先增大，而后减小。将盐酸胍和脲对蛋白质Ｚ值的影响进行了比较后发现，在疏水色谱中Ｚ值作为蛋白质分子构象变化表征的一个重要的结论是随变性剂浓度的增大，埋藏在蛋白质分子内部的疏水性氨基酸残基暴露到分子表面的程度逐渐增大，造成了Ｚ值随蛋白质分子构象变化程度的增大而减小。蛋白质的Ｚ值随盐酸胍及脲浓度变化的不同特点，反映了两者对蛋白质变性机理的不同。     

参数Z对疏水色谱中胍变蛋白质分子构象亦化的表征

用计量置换参数Ｚ对疏水色谱流动相中存在盐酸胍时蛋白质分子构象变化进行了表征。除溶菌酶外，其余４种蛋白质的Ｚ值随盐酸胍浓度的增大先增大，而后减小。蛋白质的Ｚ值随盐酸及脲浓度的增大，埋藏在蛋白质分子内     

胍变蛋白的构象变化及尺寸排阻色谱行为

通过比较６种天然和变性蛋白的色谱行为，提出在不含盐酸胍的非变性体系中利用尺寸排阻色谱法研究蛋白质的构象变化。根据色谱峰数可以判断蛋白质变性时形成变体的数目；利用峰高可以描述蛋白质变性的完全程度；根据不同波长下峰高的变化可以推断蛋白质表面氨基酸残基暴露情况；利用保留时间可以比较各种变体相对体积的大小。     

用参数Z表征疏水色谱中脲浓度与蛋白质分子的构象变化

研究了５种标准蛋白在流动相中含有不同脲浓度条件下的疏水色谱保留行为。当脲浓度不变时，蛋白质的保留仍然服从计量置换保留模型，并可测定在该特定脲浓度条件下蛋白质的Ｚ值。计量置换参数Ｚ可作为疏水色谱中生物大分子的构象变化的表征。     

胍变蛋白的构象变化及尺寸排阻色谱行为

 通过比较６种天然和变性蛋白的色谱行为，提出在不含盐酸胍的非变性体系中利用尺寸排阻色谱法研究蛋白质的构象变化。根据色谱峰数可以判断蛋白质变性时形成变体的数目；利用峰高可以描述蛋白质变性的完全程度；根据不同波长下峰高的变化可以推断蛋白质表面氨基酸残基暴露情况；利用保留时间可以比较各种变体相对体积的大小。     

金属螯合亲和色谱中的疏水作用

通过考察盐溶盐和盐析盐浓度对蛋白质在IDA裸柱和金属螯合柱上保留行为的影响,详细研究了金属螯合色谱中的疏水作用,疏水作用的发生、形成的条件以及不同条件下对蛋白质保留值的贡献。实验结果表明,在高浓度和低浓度的盐溶盐以及低浓度盐析盐中,蛋白质在金属螯合柱上的保留主要受静电和配位作用控制,而疏水作用对蛋白质的保留影响很小。对弱亲和性的金属螯合柱以静电作用为主,其大小可用参数Q表征;对强亲和性的IDA-Cu（Ⅱ）柱以配位作用为主。仅在高浓度的盐析盐中,金属螯合柱才呈现较强的疏水作用,支配蛋白质保留。实验证明,金属螯合色谱中疏水作用主要来自固定相间隔臂中的疏水碳链和盐析盐对蛋白质的增疏作用,利用这种疏水作用有可能改善金属螯合色谱分离的选择性。     

采用柔性分子对接技术模拟蛋白质在疏水作用色谱上的保留行为

将蛋白质与疏水作用色谱(HIC)固定相相互作用分为直接非键/构象作用和蛋白质表面疏水效应两个热力学过程, 从而定量给出了处于浓盐析盐水溶液中HIC保留时间与配基/蛋白质结合自由能之间的二元线性关系. 通过ICM柔性分子对接策略及遗传算法(GA)对27个已知晶体结构的蛋白质与疏水配基的可能结合方式进行模拟和分析, 所得结果与实验观测情况吻合良好. 研究表明, 蛋白质局部疏水效应以及配基与蛋白质的非键/构象作用皆对HIC色谱保留行为影响显著, 且作用区域多集中于蛋白质表面突出部位.     

在反相色谱和疏水作用色谱中温度对蛋白质保留值的影响

人们在反相色谱(RPC)和疏水作用色谱(HiC)上研究温度对蛋白质保留值影响时,常把蛋白质保留时间随温度增加而增长作为属于HIC的一个标准,将保留时间随温度增加而减小作为RPC的一个特点。实际上常常出现与之相反的保留行为。过去对于这些反常的行为解释并不令人满意。我们研     

胍变及脲变α-淀粉酶的研究 Ⅰ.用高效疏水色谱法研究变性机理和复性效率

用疏水性强弱不同的两种色谱柱对７．０ｍｏｌ／Ｌ盐酸胍及８．０ｍｏｌ／Ｌ脲变性的α－淀粉酶变体和在疏水色谱介质表面上折叠的中间体进行了分离和复性。通过研究和比较发现，两者的变性机理和形成折叠中间体的个数以及复性效率均不相同。在用疏水性较弱的疏水色谱柱对脲变α－淀粉酶的折叠中间体进行分离时，得到了疏水性接近连续的、数目很多的中间体。用疏水性较强的疏水色谱柱对胍变α－淀粉酶进行复性的效果较好。还研究了柱温变化对其折叠、分离效果和复性效率的影响。     

蛋白质在疏水色谱中的变性热力学

研究21-80℃温度范围内一些蛋白质和小分子在疏水相互作用色谱中的热行为。利用Van't Hoff作图(lnk'-1/T)测定蛋白质分子的热力学参数(ΔH°, ΔS°和ΔG°), 根据标准熵变(ΔS°)和标准自由能变(ΔG°)判断蛋白质在色谱过程中的构象变化, 通过ΔH°-ΔS°的线性关系估计蛋白质变性时的"补偿温度"(β), 鉴定蛋白质在疏水相互作用色谱中保留机理的同一性。     

用疏水色谱对还原型胍变性牛胰岛素的折叠特性研究

用疏水相互色谱(HPHIC)对还原胍变性牛胰岛素在疏水界面上的折叠与复性进行了研究.结果表明,采用普通流动相时,对还原胍变胰岛素的复性效果较差,而采用氧化型流动相可使其复性效率提高到66%,并用反相色谱(RPLC)、紫外吸收光谱、荧光光谱及MALDI-TOF对其复性效果进行了验证.同时与体积排阻色谱(SEC)和稀释法对还原胍变胰岛素的复性结果进行了比较.结果表明,SEC根本无法使还原胍变胰岛素复性,而稀释法的复性效率仅有2%.这进一步表明HPHIC是变性蛋白复性的有效工具,变性蛋白在疏水界面折叠过程中,蛋白质与固定相之间的疏水相互作用对蛋白折叠起着关键性的作用,是蛋白折叠的主要驱动力.     

采用不同疏水相互作用色谱柱从包涵体中快速制备重组人干细胞因子

为了提高重组人干细胞因子(rhSCF)的复性效率,改进了高效疏水相互作用色谱(HPHIC)纯化和复性rhSCF的方法。首先将目标蛋白溶解于8.0 mol/L脲中,然后将rhSCF包涵体的提取液直接进样到不同规格的HPHIC柱进行纯化和复性。优化了固定相配基结构和流动相组成等实验条件,结果表明,本方法可以快速地获得高质量回收率和高生物活性的rhSCF,rhSCF在40 min内即可完成复性与纯化,目标蛋白的纯度在95.5%以上,质量回收率高于49.6%。通过体积排阻色谱和基质辅助激光解吸离子化飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)的分析,确认rhSCF以单体存在。结果进一步证明HPHIC法是同时复性和纯化重组蛋白的有效工具。     

胍变及脲变α-淀粉酶的研究 Ⅰ.用高效疏水色谱法研究变性机理和复性效率

用疏水性强弱不同的两种色谱柱对７．０ｍｏｌ／Ｌ盐酸胍及８．０ｍｏｌ／Ｌ脲变性的α－淀粉酶变体和在疏水色谱介质表面上折叠的中间体进行了分离和复性。通过研究和比较发现,两者的变性机理和形成折叠中间体的个数以及复性效率均不相同。在用疏水性较弱的疏水色谱柱对脲变α－淀粉酶的折叠中间体进行分离时,得到了疏水性接近连续的、数目很多的中间体。用疏水性较强的疏水色谱柱对胍变α－淀粉酶进行复性的效果较好。还研究了柱温变化对其折叠、分离效果和复性效率的影响。     

高效疏水相互作用色谱法复性与同时纯化重组人Flt3配体的包涵体蛋白质

Flt3配体(FL)是一类具有促进早期造血功能的细胞因子,在促进造血细胞生长发育及造血动员方面具有重要的临床应用价值。为了用基因工程方法获得大量用于临床和研究的重组人FL(rhFL)蛋白质,本文对在大肠杆菌(E. coli)中表达得到的Flt3配体的包涵体进行回收、洗涤,溶解于8 mol/L脲后在高效疏水相互作用色谱(HPHIC)柱上进行rhFL包涵体的复性与同时纯化,并对其保留特征和复性规律进行了研究。结果表明,在连续进样、变性蛋白质质量浓度为8.51 g/L、固定相选用端基为PEG800、流动相添加4 mol/L脲、1.8 mmol/L 还原型谷胱甘肽(GSH)和0.3 mmol/L氧化型谷胱甘肽(GSSH)、pH 7.0的优化条件下,复性与同时纯化rhFL包涵体的质量回收率为36.9%,纯度达94.5%以上。本文仅用一步HPHIC法成功地复性与同时纯化了rhFL蛋白质,为获得高活性的rhFL产品奠定了一定的工作基础。     

蛋白质在疏水作用色谱上的保留模型及其模型参数间关系的研究

在优先水化作用和相关作用原理的基础上,从热力学出发推导出蛋白质在高效疏水作用色谱(HIC)上的保留模型,建立了模型参数间的关系式,使过去观察到的经验规律有了理论依据,并利用上述模型解释了一些蛋白质在HIC上的重要色谱特性。     

弱阳离子交换色谱中疏水作用对蛋白保留的影响

选取了四种常用的弱阳离子交换(WCX)商品柱以研究标准蛋白在其上的色谱保留行为。发现在疏水色谱(HIC)模式下,蛋白在这四种WCX商品柱上也有不同程度的保留特征,且洗脱曲线呈现出保留值随盐浓度变化的"U"型。从分子力学角度定性解释了因疏水相互作用力的存在影响了蛋白在WCX色谱柱上洗脱顺序的改变。运用计量置换理论(SDT)中的两组线性方程进一步证实了WCX和HIC中蛋白与固定相间相互作用力的性质,在HIC中为非选择性作用力,而在离子交换色谱(IEC)中为选择性作用力。这四种色谱柱中的两种事实上可在WCX和HIC两种模式下,对标准蛋白进行分离且有较好的分离效果,有可能作为二维色谱柱来使用。     

Preparation of a silica‐based high‐performance hydrophobic interaction chromatography stationary phase for protein separation and renaturation

In this work, based on the structural characteristics of bio‐membrane molecules, a novel type of high‐performance hydrophobic interaction chromatography stationary phase was prepared using cholesterol as a ligand. Investigating the separation performance of this stationary phase, the effect of pH and salt concentration of the mobile phase on the retention time, the absorption capacity, and the hydrophobic ability revealed that this stationary phase had a high loading capacity and moderate hydrophobic interactions compared with four different hydrophobic interaction chromatography stationary phase ligands. Five types of standard proteins could be baseline separated with a great selection for protein separation. When 3.0 M urea was added to the mobile phase, it could be refolded with simultaneous purification of denatured lysozyme by one‐step chromatography. The mass recovery of lysozyme reached 89.5%, and the active recovery was 96.8%. Compared with traditional hydrophobic interaction chromatography, this new stationary phase has a good hydrophobic ability and a significant refolding efficiency.     

Mechanism of simultaneously refolding and purification of proteins by hydrophobic interaction chromatographic unit and applications

The hydrophobic amino acid residues of a denatured protein molecule tend to react with the particles of the stationary phase of hydrophobic interaction chromatography (STHIC). These hydrophobic interactions prevent the denatured protein molecules from aggregating with each other. The STHIC can provide high enough energy to a denatured protein molecule to make it dehydration and to refold it into its native or various intermediate states. The outcome not only depends on the specific interactions between amino acids, the structure of STHIC, but also depends on the association between the STHIC and mobile phase. The mechanism of protein refolding and the principle of its quality control by HPHIC were also presented. By appropriate selection of the chromatographic condition, several denatured proteins can be refolded and separated simultaneously in a single chromatographic run. A specially designed unit, with diameter much larger than its length, was designed and employed for both laboratory and preparative