在线固相萃取-液相色谱-串联质谱法检测蘑菇中毒患者尿液中痕量α -鹅膏毒肽

建立了在线固相萃取-液相色谱-串联质谱（online SPE-LC-MS/MS）测定蘑菇中毒患者尿液中痕量α -鹅膏毒肽的分析方法。样品经甲酸酸化的乙腈-甲醇（5：1，v/v）沉淀蛋白质，反相液液微萃取去除样品提取液中的有机溶剂，毒素经ODS微柱（5 mm×2.1 mm，5 μm）在线SPE净化，XBridge^TM BEH C₁₈ 色谱柱（150 mm×3.0 mm，2.5 μm）分离，MS/MS测定。采用基于定量环的快速阀切换技术作为在线SPE和LC-MS/MS模块的接口，使得两个分离模块互相独立，无论是流动相还是压力，都不会互相干扰，保证了系统的稳定性；在线系统的精准净化，有效消除了后续质谱检测的基质效应，确保了尿液中痕量水平α -鹅膏毒肽的定性定量检测。尿液中α -鹅膏毒肽在0.1~50 μg/L范围内线性关系良好，相关系数（r ² ）为0.9983；检出限（LOD）为0.03 μg/L；α -鹅膏毒肽的加标（0.1、2.0和20 μg/L）平均回收率为84.3%~91.7%，相对标准偏差（RSD）为3.8%~7.2%。体内鹅膏毒肽代谢迅速，生物基质中痕量水平毒素的检测是其中毒实验室鉴定的主要难题，通过实际样品检测，证明该法操作简单，准确、灵敏；溶剂沉淀蛋白质和反相液液微萃取去除有机相和脂溶性基质的简单操作，可以作为水溶性毒素在线SPE-LC-MS/MS检测时快速且有效的配套前处理方法；基于在线SPE精准净化技术，可以实现尿液中α -鹅膏毒肽的高灵敏度测定（LOD为0.03 μg/L），解决了中毒时患者体内痕量水平α -鹅膏毒肽定性确证的难题，部分患者α -鹅膏毒肽中毒实验室鉴定的时间可以扩展到90 h以上；同时，痕量水平的定量检测技术，可以为中毒后迅速代谢的α -鹅膏毒肽在体内的剂量反应关系研究提供可靠的技术支撑。