转染人凝血因子Ⅸ cDNA的血友病B患者皮肤成纤维细胞在小鼠体内的高效表达

本文报道了一个带有增强子的人巨细胞病毒(hCMV)启动子和人凝血因子ⅨcDNA的双拷贝反转录病毒载体(double-copy retroviral vector)-N2CMVIX的构建,转染PA317包装细胞后再离体感染血友病B患者皮肤成纤维细胞,可产生具有凝血活性的Ⅸ因子蛋白高达3420 ng/10~6细胞/24 h。将这些转染人Ⅸ因子cDNA的成纤维细胞包埋于胶原,植入小鼠皮下或腹腔内,人凝血因子Ⅸ蛋白表达最高值达105 ng/ml血浆,可在小鼠体内持续表达12天,其中90％以上的Ⅸ因子具有凝血话性,为血友病B基因治疗临床试验提供了一条可行的技术路线。     

介导GAD基因的人泡沫病毒载体的构建及其应用

构建了两种新的重组人泡沫病毒载体pGPSNI—hGAD67和pGPSNI—hGAD65，分别携带人符氨酸脱羧酶（GAD）的两种同工酶GAD65和GAD67基因，并研究其在帕金森病（PD）模刭鼠丘脑底核中的表达及对帕金森病的治疗作用．RT—PCR结果表明，人泡沫病毒载体成功地介导了GAD65基因和GAD67基因在PD模型鼠丘脑底核中有效表达．动物行为检测表明，GAD65基因导入组PD模型鼠行为与对照组相比得到明显的改善（n=12，由〈0．01）．     

成纤维细胞基因治疗血友病B的临床Ⅰ期试验

本文首次报道了以皮肤成纤维细胞为靶细胞,对血友病B患者实施基因治疗的监床Ⅰ期试验。首先用构建有人凝血因子Ⅸ cDNA的反转录病毒载体(XL-Ⅸ和N2 CMV-Ⅸ)感染血友病B患者皮肤成纤维细胞(HBSF),选择得到表达有人Ⅸ因子蛋白的细胞,而后进行一系列安全性检测,包括细胞连续传代形态观察;染色体分析,软琼脂试验;裸鼠接种试验;胶原过敏试验;内毒素试验等,在确定表达人Ⅸ因子蛋白的细胞的安全性后,大量扩增细胞,最后,细胞用胶原包埋,直接注射到血友病B患者腹部或背部皮下。患者1体内凝血因子IX浓度从71ng/ml上升到约240 ng/ml,至今维持在220ng/ml,持续表达6个月,凝血因子Ⅸ的凝血活性也从2.9％上升到6.3％,该患者的临床症状改善;患者2体内凝血因子Ⅸ浓度亦从130 ng/ml上升到约280 ng/ml,至今维持在220 ng/ml,持续表达5个多月,但活性增加不稳定。两名受试者至今没有发现任何副作用和危害,正在随访之中。我们认为反转录病毒介导的基因转移自体皮肤成纤维细胞,用胶原包埋,皮下移植是安全可靠的,也是简便易行的,从而成功地完成了血友病B基因治疗的临床Ⅰ期试验。     

人凝血Ⅸ因子cDNA在转基因小鼠内的表达调控

为了研究人凝血IX因子cDNA在转基因小鼠内的表达,特别是顺式调节顺序的存在位置,本文将3种具有不同结构的人凝血IX因子cDNA的重组基因导入离体培养细胞,发现外源的人IX因子cDNA都能表达人IX因子蛋白,进而将它们分别作成转基因小鼠,结果发现在转基因小鼠内都失去了表达特性。这些结果证实了在人凝血IX因子cDNA中存在着决定其在转基因小鼠内表达的顺式调节顺序,同时也排除了这种顺式调节顺序存在于3′端非编码顺序中的可能性。作者再结合一些相关研究的结果,认为其顺式调节顺序可能存在于5′端的非编码顺序中。     

小鼠B7-1cDNA克隆、测序、表达及其抗瘤效应的初步探讨

用反转录ＰＣＲ的方法,从ＢＡＬＢ／ｃ小鼠脾细胞中扩增出Ｂ７－１ｃＤＮＡ后,插入ｐｃＤＮＡ３质粒中构建成小鼠Ｂ７－１ｃＤＮＡ的真核表达载体ｐＣＤ－ｍＢ７．１,经酶切鉴定和序列分析证实此表达载体中插入的Ｂ７－１ｃＤＮＡ的序列与文献报道一致．通过脂质体介导将ｐＣＤ－ｍＢ７．１导入Ｂ７－１的小鼠黑色素瘤细胞系Ｂ１６（Ｆ０）中,经ＲＴ－ＰＣＲ和ＲＮＡ斑点杂交初步证实Ｂ７－１在肿瘤细胞中获得了稳定有效的表达．同源小鼠脾淋巴细胞与肿瘤细胞混合培养后采用ＬＤＨ释放改良法测定淋巴细胞特异杀伤活性,结果显示,与野生型和模拟转染的Ｂ１６细胞相比,Ｂ７－１基因转染的Ｂ１６细胞能较有效诱导淋巴细胞产生针对野生型Ｂ１６细胞的特异杀伤活性（ｐ＜０．０２）．这说明,将Ｂ７－１基因导入肿瘤细胞表达能提高其免疫原性,诱导有效的抗肿瘤免疫反应     

腺病毒载体与肿瘤基因治疗

基因导入系统是恶性肿瘤基因治疗中急需解决的问题．由于腺病毒作为载体介导外源效应基因在肿瘤细胞中的高效表达,使其应用日趋增多．用于肿瘤基因治疗的腺病毒可分为复制缺陷型和复制型．常用的效应基因包括：抑癌基因,前药转换酶基因,核酶基因和细胞因子基因等     

Polyethylenimine （PEI）-g-comb-poly（ethylene glycol）-transferrin（Ⅰ）： Tumor-targeted Vector for Gene Delivery In.vitro

The work described the synthesis and evaluation of PEI-g-comb-PEG-transferrin as a potential system for gene therapy in vitro. The MW of PEG was 10KDa, and PEI was 2KDa. Its structure was identified by NMR, FT-IR and TGA spectroscopy. MTT assay found that at concentration up to 4000 n mol/L of the polymer, cell viability was over 85%. The bio-character of polymer/DNA complex was characterized by agarose gel electrophoresis, ethidium bromide exclusion and zeta-potential assay. The polymer could retardate DNA at N/P ratio 3.0-3.5 （mol/mol）. The particle size of the polymer/DNA complex was less than 300 nm. Transfection efficiency of the complex was studied in COS7 and NT2 cell lines.     

人凝血因子Ⅸ在家兔体内的持续表达

本文报道用构建有人凝血因子Ⅸ cDNA的重组质粒(pCMV Ⅸ)或重组反转录病毒(XLⅨ和N2CMVⅨ)转染家兔原代培养的皮肤成纤维细胞(RSF),经过选择后将转有人Ⅸ因子cDNA的细胞包埋于胶原基质,然后进行自体或同种异体移植。腹腔移植有RSF-XLⅨ转化细胞的家兔血浆中人Ⅸ因子表达水平可达100ng/ml,表达持续5个半月;腹腔移植有RSF-pCMVⅨ细胞的家兔血浆中人Ⅸ因子水平可高达2.95ng/ml,表达至今已超过10个月,而且仍在继续检测中。在移植方法上,我们做了进一步改进,将收缩后的细胞胶原块移植改为细胞胶原液注射,使移植方法更简便有效,无需进行手术,用此法皮下移植有RSF-N2CMVⅨ转化细胞的家兔血浆中,人Ⅸ因子表达水平可高达480ng/ml,表达至今已有3个多月,其持续表达的趋势仍很乐观,为基因治疗的临床试验提供了一条更加切实可行的技术路线。     

TNFa在血管内皮细胞ECV304中的靶向表达研究

在缺失了3'LTR U3区内病毒的启动子／增强子序列的逆转录病毒载体pLXSNd中,用血管内皮生长因子受体KDR的特异性启动子调控了TNFa在血管内细胞ECV304中的靶向表达。将构建的载体pLXSN-TNFa,pLXSNd-KDRp-TNFa和空载体pLXSN用PA317细胞包装后获得重组病毒,并用重组病毒分别感染NIH3T3细胞和ECV304细胞,培养物上清的ELISA结果证明,KDR启动子指导的TNFa在KDR阳性细胞ECV304中的表达量为在KDR阴性细胞NIH3T3中的表达量的8倍;而TR指导的TNFa在这两种细胞中的表达无明显差异,实现了TNFa在血管内皮细胞中的靶向表达,这可能为肿瘤基因治疗提供新途径。