蛋清溶菌酶基因的密码子优化及其在毕赤酵母中的分泌表达

作为一种天然的抑菌物质,溶菌酶对抗生素耐药菌有较强的杀伤作用，具有无耐药性、无残留等特点，被认为在诸如动物饲料、药品等领域可有效代替抗生素，改善滥用抗生素所引起的一系列问题，市场前景巨大。通过微生物发酵大规模生产重组溶菌酶符合市场发展趋势，由于目前生产的菌株表达量偏低，限制了溶菌酶的应用和产业化发展。为提高蛋清溶菌酶的发酵表达量，根据毕赤酵母密码子的偏爱性,对其编码基因进行密码子优化，并构建了真核分泌表达载体pPIC9K-coEWL，经遗传霉素G418抗性筛选后，获得了一株酵母转化子(G-p-coEWL)，其对G418的抗性浓度高达15 mg·mL^-1。在28℃、pH 6.0、转速240 r·min^-1和甲醇浓度1%的诱导条件下,酵母重组子G-p-coEWL经摇瓶培养72 h，实现了蛋清溶菌酶的分泌表达。在发酵上清液中，总蛋白浓度为 607 mg·L^-1，酶活达到677 U·mL^-1。此外，本实验还比较了葡聚糖凝胶柱Sephadex G-50和强酸性阳离子交换柱SP-Sepharose FF两种方法对目的蛋白的分离效果,得到 Sephadex G-50的分离效果更好，并在14.4 kDa处得到单一的溶菌酶条带。     

密码子优化的人溶菌酶基因在毕赤酵母中的分泌表达及抗菌活性分析

人溶菌酶（human lysozyme,hLYZ）是一种天然活性蛋白质,具有抗菌性,目前主要应用于食品添加剂、动物饲料、药物治疗领域。根据毕赤酵母表达偏爱密码子特点,通过优化hlyz基因密码子,人工合成目的基因,构建了分泌表达载体pPIC9K-hlyz。通过电击转化法将pPIC9K-hly质粒重组至毕赤酵母GS115染色体中,经筛选得到重组毕赤酵母GS115-pPIC9K-hlyz。在28 ℃、pH 6.0、转速240 r·min^-1、1%甲醇诱导下表达120 h,发酵液上清酶活达到最高,为（2 414.9±108.1）U·mL^-1,蛋白浓度为166.7 μg·mL^-1。发酵液上清经过Sephadex G50纯化,获得较纯的hLYZ,经SDS-PAGE分析,在近14.7 kDa处显示单一条带。抗菌实验结果表明,重组hLYZ对革兰氏阳性菌的抗菌效果大于革兰氏阴性菌;重组hLYZ的抗菌效果是hLYZ标准品的10~20倍。     

蛋清溶菌酶基因的密码子优化及其在毕赤酵母中的分泌表达

作为一种天然的抑菌物质,溶菌酶对抗生素耐药菌有较强的杀伤作用，具有无耐药性、无残留等特点，被认为在诸如动物饲料、药品等领域可有效代替抗生素，改善滥用抗生素所引起的一系列问题，市场前景巨大。通过微生物发酵大规模生产重组溶菌酶符合市场发展趋势，由于目前生产的菌株表达量偏低，限制了溶菌酶的应用和产业化发展。为提高蛋清溶菌酶的发酵表达量，根据毕赤酵母密码子的偏爱性,对其编码基因进行密码子优化，并构建了真核分泌表达载体pPIC9K-coEWL，经遗传霉素G418抗性筛选后，获得了一株酵母转化子(G-p-coEWL)，其对G418的抗性浓度高达15 mg·mL^-1。在28℃、pH 6.0、转速240 r·min^-1和甲醇浓度1%的诱导条件下,酵母重组子G-p-coEWL经摇瓶培养72 h，实现了蛋清溶菌酶的分泌表达。在发酵上清液中，总蛋白浓度为 607 mg·L^-1，酶活达到677 U·mL^-1。此外，本实验还比较了葡聚糖凝胶柱Sephadex G-50和强酸性阳离子交换柱SP-Sepharose FF两种方法对目的蛋白的分离效果,得到 Sephadex G-50的分离效果更好，并在14.4 kDa处得到单一的溶菌酶条带。