HCVNS2基因表达载体的构建及在E.coli中表达

PCR人含有丙肝病毒全长非结构蛋白的载体pBlueBac25中扩增出全长的NS2基因DNA片段,分别克隆到表达载体pQE30和转座载体pFasBacHTb的多隆位点（MCS）,PFastNS2通过转座插入穿梭载体Bacmid的表达盒;pQENS2转化JM109菌株,诱导表达出N端含有6个His的全长His的全长NS2蛋白,用Ni-NTA-agarose柱层纯化,获得提纯的全长NS2蛋白。     

人t-PA P区在大肠杆菌中表达及其活性研究

用PCR方法获得编码人组织型纤溶酶原激活物（tissure-typeplasminogenactivator,t-PA）C端P区肽段的DNA,并经测序证实,长810bp,含有全部的t-PA的丝氨酸蛋白酶编码序列.将这段序列克隆到表达载体pQE30中转化大肠杆菌JM109菌株,经SDS-PAGE检测转化菌株中表达出分子量约29×103的蛋白,用纤维平板法测定激活纤溶活性,结果表明表达的t-PA蛋白C端P区具有很强的激活纤溶蛋白酶原的活性.证实t-PA蛋白C端P区的酶结构区的功能是独立的,其生物活性不受其它区域影响．     

N-(O,S-二甲基硫代磷酰基)α-L-氨基酸酯的合成及其杀虫活性

从α-L-氨基酸酯在摩尔级高产率制备了光学纯N-(O,S-二甲基硫代磷酰基)α-L-氨基酸酯. 利用IR,1H-NMR,摩尔旋光鉴定了结构特征,利用生物测试法研究了杀虫活性.4 种活性氨基酸杀虫剂在0.01% ～0.001% 浓度内,它们对两令棉铃虫的触杀死亡率为100% ～80% ,胃杀死亡率为95% ～50% ,而且杀虫活性有随活性氨基酸杀虫剂分子中R-基团碳链增长而增强的趋势.     

丙型肝炎病毒包膜蛋白E1在小鼠和家兔中免疫应答研究

探讨丙型肝炎病毒包膜蛋白E1作为丙肝候选疫苗的可行性．用大肠杆菌表达的非糖基化HCV(丙型肝炎病毒)E1包涵体蛋白免疫小鼠和家兔，分析该包涵体蛋白在小鼠和家兔中所引起的免疫应答及其安全性．该E1蛋白具有良好的免疫原性，能诱导小鼠和家兔产生针对E1的特异性体液免疫应答．小鼠CD8^ T细胞数量在免疫后有明显升高．免疫小鼠未见明显的毒副作用．推测HCV E1这种包涵体结构可能有利于E1抗原的呈递．而HCV E1蛋白的糖基化并不是其免疫原性所必须的．     

不同复性条件对重组人组织纤溶酶原激活剂复性的影响

大肠杆菌生产菌株诱导表达产生的无活性重组人组织纤溶酶原激活剂(tissue-type plasminogen activator,tPA)包涵体蛋白,溶解于尿素中变性后进行复性.通过单因子试验和正交试验考察了不同复性条件下透析复性对tPA包涵体蛋白复性效率的影响.结果表明蛋白质浓度、复性温度、pH值、复性介质、还原剂浓度对tPA的复性效果都有不同程度的影响,当0.5 g/L tPA包涵体蛋白溶解于pH 9.5的7 mol/L的尿素,加入5 mmol/L β-巯基乙醇,在20 ℃、pH 8.0的双蒸水条件下复性时,可以取得最高的复性效率(2.0×107IU/g).通过对稀释复性、透析复性和凝胶过滤层析复性3种方法比较,建立了适宜工业化生产tPA的复性方法.     

人丙型肝炎病毒核心抗原基因的表达和纯化

人丙型肝炎病毒Ｉ型（ＨＣＶ－Ｉ）核心抗原编码区ｃＤＮＡ，全长５７３ｂｐ，编码１９１个氨基酸，被克隆到一种新的表达质粒ｐＲＳＥＴＨｉｓＢ中，转化大肠菌ＢＬ２１菌株，在１ｍｍｏｌＬ－１ＩＰＴＧ诱导３７℃培养５ｈ，核心抗原表达水平达到高峰，表达出分子量２６×１０３的融合蛋白，并在细胞内形成微小晶体．表达水平达到细胞总蛋白的４０％左右，通过纯化，获得的核心抗原经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ检查为均一分子量２６×１０３的蛋白，用酶联免疫法进行血清学初步检查，纯化的核心抗原与ＨＣＶ阳性血清显示出强烈的阳性反应，对慢性丙肝病人血清中抗ＨＣＶ抗体的阳性检出率达９３％，而与正常人血清则无阳性反应     

丙型肝炎病毒NS5B基因在昆虫细胞中的表达

将含有丙型肝炎病毒（HCV）NS5B基因的转移载体pBlueBac5B与野生型杆状病毒(AcNPV)DNA共转染Sf9昆虫细胞,通过空斑纯化获得带有NS5B基因的重组病毒AcNS5B.提取重组病毒基因组DNA进行Southern分析,发现有一条1.8kb的DNA片段与标记的探针发生杂交.AcNS5B感染Sf9细胞后,在细胞中表达了分子量为66×103的蛋白,用Westernblot方法检查这种蛋白质,能与兔抗HCVNS5B抗血清发生特异的强烈反应.     

HCVNS4基因在大肠杆菌中表达及蛋白质提纯

应用PCR方法扩增出人丙型肝炎病毒全长NS4基因的DNA片段,克隆入表达载体pQE32并转化E.coliJM109.经IPTG诱导表达出42×l03蛋白.利用Ni-NTA-agarose纯化得到纯化产物,Western-blot鉴定该蛋白能够与抗NS4的单克隆抗体发生特异性反应.     

重组tPA及其突变体纤溶活性的比较

将重组基因rtPA及其突变体rtPAm分别克隆到原核表达载体pET his上,通过平板筛选,双酶切和PCR鉴定获得阳性克隆子,重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3).经IPTG诱导,表达出的两种tPA蛋白都形成不可溶的包涵体.SDS PAGE结果显示两种tPA蛋白分子量为4.0×104左右,表达产量较高.包涵体经尿素变性,透析复性后柱层析纯化,纤溶平板法测定激活纤溶蛋白酶的活性,结果显示rtPAm比活性比rtPA高70%左右.     

重组pQE30 tPAr质粒在JM109菌株中的稳定性研究

将构建好的含有人变异tPA基因的重组pQE30 tPAr质粒的JM109菌株原始种子库菌种，在含Amp的平板培养基划线法连续传代至100代，其在固体培养基中生长速度、菌落形态和菌体形态、Amp抗性等方面与原始种子库无明显差异；每隔10代提取质粒DNA用HindⅢ和KpnⅠ限制性内切酶切割检查，酶切图谱没有改变；DNA测序未见tPAr基因变异．用原代和第100代培养诱导表达tPAr,表达水平和tPAr活性均无明显差异．菌体的SDS-pAGE图谱也完全相同．以上结果表明所建立的JM109tPAr工程菌株具有良好的遗传稳定性．