脱辅基神经红蛋白热稳定性的光谱法研究

采用酸丙酮法制备了脱辅基神经红蛋白(apo-Ngb)。利用紫外-可见吸收光谱和圆二色光谱(CD)对apo-Ngb的热稳定性进行了研究。结果表明,在高温下apo-Ngb发生了变性,其二级结构遭到破坏,α-螺旋的含量减少。计算得到了apo-Ngb热变性的中点温度(61.8℃)和热力学参数(ΔH=93.1 kJ·mol-1,ΔS=277.8J·mol-1·K-1)。与Ngb相比,由于血红素辅基的去除,apo-Ngb蛋白肽链结构变得疏松无序,从而使apo-Ngb的热稳定性有所降低。     

化学与酶促相结合合成人生长激素基因

根据人生长激素(hGH)的氨基酸序列和大肠杆菌密码子的偏好性, 全面优化hGH的密码子, 添加表达调控元件后合成序列的全长为1040 bp, 采用化学方法拆分成30条单链寡核苷酸. 采用改进的两步法拼接成全基因, 得到2个全序列正确的基因. DA-PCR和OE-PCR拼接产物经T7核酸内切酶Ⅰ处理, 合成基因中的碱基错误率降低了93.93％.     

来源于Alcaligenes A-6的D-氨基酰化酶基因的合成与融合表达

将来源于Alcaligenes A-6的D-氨基酰化酶基因用大肠杆菌中的丰沛密码子替换, 利用化学和基于聚合酶链反应(PCR)技术的酶促方法进行基因全合成, 利用pET-32a构建重组表达载体pET-dan, 转化进E.coil BL21(DE3)中进行融合表达. 经SDS-PAGE电泳、 Western-blot检测和活性测定发现, D-ANase可在大肠杆菌中高效表达, 目的蛋白可达到菌体总蛋白的69.2%, 密码子优化后基因构建的工程菌发酵活性为96 U/mL, 重组蛋白经超声细胞破碎及Ni²⁺柱亲和层析纯化, 比活可达1692.3 U/mg, 纯度可达95%以上.     

神经红蛋白突变体H64V与叠氮离子的作用

将64位组氨酸(His64)突变为缬氨酸(Val),构建了神经红蛋白(Ngb)突变体H64V基因并进行了蛋白的表达纯化,突变使Ngb的血红素Fe由六配位结构变成五配位结构.利用光谱法研究了突变体H64V与叠氮离子(N_3~-)的相互作用.紫外-可见吸收光谱表明,H64V与N_3~-键合后其Soret带吸收峰由406 nm红移至418 nm;荧光光谱表明N_3~-可使H64V的荧光发生静态猝灭.计算得到了H64V与N_3~-键合的平衡解离常数和热力学参数.另外,还研究了不同阴离子对H64V与N_3~-结合的影响,发现阴离子的存在减弱了N_3~-与H64V之间的结合力.