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测试并优化了哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(m TOR)的FAT结构域及其亚结构域TRD2和DEPTOR蛋白在大肠杆菌中的表达条件,获得了TRD2和DEPTOR蛋白成功表达并大量纯化的条件.结果表明,麦芽糖结合蛋白(MBP)融合m TOR的TRD2亚结构域可以在菌株BL21(DE3)中大量表达.DEPTOR-G270P突变比野生型DEPTOR在BL21(DE3)中的表达量提高约5倍,且该突变并不影响DEPTOR自身的二级结构.通过凝胶过滤实验发现,m TOR的TRD2亚结构域和DEPTOR之间可能存在相互作用. 相似文献
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大肠杆菌在细胞分裂时,细胞中部潜在分裂位点的选择受到Min系统(Min C、Min D和Min E蛋白)的精确调控,其中Min C与Min D可以形成复合物以抑制Z分裂环在错误的位置形成。本研究采用基因克隆方法获得min C、min D基因的克隆,并表达得到Min C和Min D的重组蛋白,用亲和层析与凝胶过滤层析对所得蛋白进行纯化,通过min C、min D分别单独转化、表达纯化后混合和min C、min D共转化法两种方法得到Min CD蛋白复合物,并分别对其进行晶体筛选。结果表明,共转化法得到的Min CD复合物纯度较好,且比例约为2∶1,通过晶体筛选初步获得针状蛋白晶体,为Min CD复合物的结构解析提供了实验基础。 相似文献
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大肠杆菌在细胞分裂时,FtsZ(Filamentous temperature-sensitive protein Z)蛋白会在细胞中部潜在位点聚合形成Z环,而MinC蛋白会抑制Z环形成,从而控制细胞分裂。本研究将min C与fts Z目的基因克隆到合适的载体中,并导入到大肠杆菌中进行表达,采用亲和层析和分子筛纯化的方法得到MinC/FtsZ复合物蛋白进行晶体筛选。通过FtsZ、MinC分别单独转化、表达纯化后混合和FtsZ、MinC共转化法两种方法得到FtsZ/MinC蛋白复合物,并分别对其进行晶体筛选。实验结果表明,在适宜的表达条件下,利用分别转化、纯化再混合的方法得到的FtsZ和MinC蛋白复合比例约为1∶1;混合时加入GTP和Mg Cl2可以促进复合物聚集态更单一,通过晶体筛选初步得到形状为针状的FtsZ/MinC复合蛋白晶体,为MinC/FtsZ复合物的结构解析提供实验基础。 相似文献
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线粒体钙离子单向转运体是一种位于线粒体内膜上的转运蛋白,具有选择和传导钙离子的功能,参与多种细胞的生理过程。目前已经确定了该单向转运体的组成成员,其中包括离子转运蛋白MCU、MCU的负调控亚基MCUb、2个Ca2+结合蛋白MICU1、MICU2以及MCU的调控亚基EMRE蛋白。近十多年来已经有大量的研究提出并构建了多种线粒体通过该单向转运体调节Ca2+摄取的模型。最近对其研究的重点转向单向转运体单个组分的结构以及对它们复合体的结构表征。这些问题的解决得益于结构生物学中核磁共振技术、X射线衍射技术的持续发展和冷冻电镜技术的突破。回顾了结构生物学技术在有关单向转运体结构问题过程中的综合运用。这一内容将有助于我们了解核磁共振、X射线晶体学以及冷冻电镜技术各自的优缺点,同时深入探究线粒体钙离子单向转运体各部分的结构及其发挥功能的分子机制。 相似文献
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采用基因重组方法构建来源于大肠杆菌和铜绿假单胞菌的waa P基因的克隆,利用多种感受态细胞表达出带有不同纯化标签的可溶性Waa P蛋白,并利用亲合层析和凝胶过滤层析对可溶性Waa P蛋白进行纯化,用SDS-PAGE进行检测。对比大肠杆菌和铜绿假单胞菌中Waa P的表达和纯化结果,为蛋白结晶选取能够得到大量稳定和高纯度Waa P蛋白的表达纯化方法,并用该方法,使用硒代甲硫氨酸培养基表达出硒代甲硫氨酸标记的Waa P,为蛋白结构解析时相位的确定提供依据。 相似文献
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