免疫磁珠捕获富集结合HPLC-Q-TOF/MS技术分析复杂水样中的蓖麻毒素

以自来水、海水以及国际禁化武组织(OPCW)官方水平考试水样为背景基质,在优化仪器参数的基础上,建立了3种水样基质中蓖麻毒素的高效液相色谱-四极杆/飞行时间质谱(HPLC-Q-TOF/MS)分析方法。蓖麻毒素在3种基质中的检出限分别为0.05,0.20,1.00μg/m L,HPLC-Q-TOF/MS测得蓖麻毒素的分子量为62 884.97 Da。为提高复杂水样的分析灵敏度,采用连接有蓖麻毒素单克隆抗体6A6的免疫磁珠对不同水样中的蓖麻毒素进行富集与纯化,利用酶联免疫吸附(ELISA)法绘制了免疫磁珠捕获方法的工作曲线,在5.00~100μg/m L线性范围内,不同浓度加标样品的回收率为82.1%~88.8%,相对标准偏差为4.2%~5.9%。将免疫捕获技术与HPLC-Q-TOF/MS分析方法相结合,对真实蓖麻毒素加标样品进行分析,3种基质中蓖麻毒素的检出限分别达2.5,10,50 ng/m L。本方法可用于水样中痕量蓖麻毒素的快速、有效检测。     

3,4-二巯基甲苯衍生化法结合SPME/GC-MS技术分析尿样中超痕量氯乙烯基胂酸

选取氯乙烯基胂酸(CVAOA)为生物标志物,建立了路易氏剂染毒尿样中超痕量CVAOA的分析方法。采用正交试验,优化了CVAOA的巯基化衍生方法,选取3,4-二巯基甲苯(DMT)作为衍生试剂,CVAOA与DMT的用量摩尔比为1∶1 000,常温衍生5 min,可达到最高的衍生效率;之后在优化的顶空-固相微萃取(HS-SPME)条件下富集纯化衍生产物CVAOA-DMT;使用气相色谱-质谱/选择离子监测模式(GC-MS/SIM)进行定性定量分析。该方法在50.0 pg/m L~500 ng/m L浓度范围内呈良好的线性(r2=0.998 5),相对标准偏差(RSD)小于10%,检出限可达7.6 pg/m L,定量下限为23 pg/m L。对低、中、高3种浓度的路易氏剂染毒尿样进行检测,回收率为97.6%~105%,RSD为4.4%~7.1%。该方法分析灵敏度高,具有良好的准确度、精密度和普及性,可被广泛推广和使用。     

剧毒性Ⅱ型核糖体失活蛋白蓖麻毒素和相思子毒素的检测鉴定方法研究进展

Ⅱ型核糖体失活蛋白(RIPs)是一类重要的蛋白毒素,该类毒素大都具有一对二硫键连接的A-B链结构特征,B链具有半乳糖结合特性,能够与真核细胞膜表面受体特异性结合,将具有N-糖苷酶活性的A链导入细胞,与核糖体特定位点发生脱嘌呤作用使核糖体失活,最终通过抑制蛋白质合成而展现出细胞毒性。Ⅱ型RIPs毒素毒性极强,来源于植物的蓖麻毒素(ricin)和相思子毒素(abrin)的毒性分别是神经性毒剂维埃克斯(Vx)的385倍和2885倍。同时,该类毒素来源广泛、易于制备、稳定性好,成为一类潜在化生恐怖战剂,受到国内外广泛关注,其中蓖麻毒素作为唯一的蛋白毒素被收录于禁止化学武器公约禁控清单。近年来发生的多次蓖麻毒素邮件恐怖事件,进一步促进了有关Ⅱ型RIPs毒素的准确、灵敏、快速的检测鉴定技术的发展。剧毒性Ⅱ型RIPs毒素的检测鉴定方法主要涉及免疫分析法为代表的特异性识别和生物质谱分析为主的定性定量检测方法,以及基于脱嘌呤反应活性和细胞毒性的毒素活性检测方法。基于抗原-抗体作用的免疫检测法及基于寡核苷酸适配体的特异性识别检测法具有速度快、灵敏度高的优势,但对于复杂样品中高度同源蛋白的检测,易产生假阳性结果。随着生物质谱技术的快速发展,电喷雾离化(ESI)或基质辅助激光解吸离化(MALDI)等技术广泛应用于蛋白质的准确鉴定,不仅能够提供蛋白毒素的准确分子量和结构序列信息,而且能够实现准确定量。酶解质谱法是应用最为广泛的检测鉴定方法,通过酶解肽指纹谱分析,实现蛋白毒素的准确鉴定;对于复杂样品中蛋白毒素的分析,通过多种蛋白酶酶解策略获得丰富的特异性肽段标志物,然后进行肽段标志物的靶向质谱分析从而获得准确的定性及定量信息,方法有效提升了Ⅱ型RIPs毒素鉴定的准确度和灵敏度。免疫分析法和生物质谱法能够准确鉴定Ⅱ型RIPs毒素,但无法识别毒素是否还保持毒性。对于Ⅱ型RIPs毒素的活性分析,主要包括基于N-糖苷酶活性的脱嘌呤反应测定法和细胞毒性测定法,两种方法均可实现毒素毒性的简便、快速、灵敏的分析检测,是Ⅱ型RIPs毒素检测方法的有效补充。由于该类毒素的高度敏感性,国际禁止化学武器组织(OPCW)对相关样品中Ⅱ型RIPs毒素的分析提出了唯一性鉴定的技术要求。该文引用了Ⅱ型RIPs毒素及其检测方法相关的70篇文献,综述了以上Ⅱ型RIPs毒素的结构性质、中毒机理及典型剧毒性Ⅱ型RIPs毒素检测方法的研究进展,对不同检测方法的特点和应用潜力进行了总结,并结合OPCW对Ⅱ型RIPs毒素唯一性鉴定的技术需求,展望了未来Ⅱ型RIPs毒素检测技术研究的发展趋势。     

超高效液相色谱-串联质谱法同时检测人血浆中6种芥子气染毒标识物

针对芥子气( HD)染毒血浆的溯源性分析需求,采用超高效液相色谱-串联质谱技术( UHPLC-MS/MS),建立了人血浆中6种HD生物标识物( TDG,TDGO,SMO,SBMSE,MSMTESE,SBSNAE)的高灵敏度和专属性检测方法。应用甲醇和乙腈混合有机溶剂沉淀HD染毒血浆中的蛋白,然后用HLB柱固相萃取( SPE)纯化,经超高效液相色谱梯度洗脱分离,在三重四极杆串联质谱正离子多反应监测( MRM)模式下进行定性与定量检测。结果表明,6种目标物的线性范围为0.05~500 ng/mL(R2=0.9840~0.9955),检测限在0.01~1.0 ng/mL之间,各分析物的精密度(n=5)≤5.5%,加标回收率在86.5%~110.8%之间。本方法通过SPE的引入和UHPLC程序的优化,有效地解决了基质背景对分析可靠性的影响问题,并成功应用于国际禁止化学武器组织( OPCW)第5次生物医学样品分析演练HD染毒血浆样品的鉴定。     

PCW第42次环境样品水平考试洗消废水中化武相关化合物的液相色谱-质谱分析

采用液相色谱-质谱技术（LC-MS）对禁止化学武器组织（OPCW）第42次水平考试洗消废水中化武相关化合物进行了详细地分析。首先用高效液相色谱-四极杆飞行时间高分辨质谱（HPLC-Q-TOF MS）从3个洗消废水样品中分辨出空白、控制与模拟真实样品,在模拟真实样品中初步找到3种化武相关化合物;随后采用超高效液相色谱-三重四极杆质谱（UPLC-QQQ MS）对这3种化武相关化合物进一步分析,鉴定出模拟真实样品中的2 羟乙基乙烯基硫醚、二乙烯基砜和1,2-双-（2-羟乙基巯基）乙烷。并对流动相中添加的缓冲剂以及质谱电离碎裂电压与裂解途径进行了优化。所得结果与OPCW提供的配样清单完全一致。该方法可为芥子气洗消产物的分析研究提供参考。     

沙土中5种神经性毒剂降解产物的实时直接分析-质谱法快速检测

建立了实时直接分析离子源-质谱（DART-MS）快速检测沙土中5种神经性毒剂降解产物的方法。方法在0.03～10 mg/L范围内线性关系良好，检出限为0.03～0.1 mg/kg, 5种神经性毒剂降解产物在沙土中的回收率均不低于71.8%，相对标准偏差（RSD）不超过11%。利用建立的DART-MS定性方法分析了禁止化学武器组织（OPCW）的PT48次环境样品水平考试盲样样品，根据获得的母离子和碎片离子的高分辨质谱（HRMS）数据及MS/HRMS质谱碎裂特征，鉴定出所有适合DART-MS分析的化学毒剂相关化合物，与OPCW发布的配样清单一致。