基于强阳离子交换色谱与等电聚焦的磷酸化蛋白质组学分离策略比较

比较分析了强阳离子交换(SCX)与等电聚焦(IPG-IEF)技术在磷酸化蛋白质组学中的应用。采用3种标准磷酸化蛋白对SCX与IPG-IEF两种技术对磷酸化肽段富集的有效性进行考察。以HepG2细胞为复杂样本,考察SCX与IPG-IEF在实际样本中的应用情况。对SCX与IPG-IEF技术在18O标记的磷酸化蛋白质组定量研究中的应用情况进行考察。蛋白鉴定采用高准确度、高灵敏度、高分辨率的LTQ-FTICR-MS/MS质谱仪。实验表明:SCX和IPG-IEF在大规模磷酸化肽段分离过程中均有效;在复杂样本中,SCX技术的分离效果优于IPG-IEF;IPG-IEF的重复性好于SCX;在磷酸化蛋白质组定量分析结果表明,IPG-IEF技术的稳定性优于SCX。本研究为根据不同实验目的而选择适当的磷酸化蛋白质组预分离技术提供了有用信息。     

免疫质谱法检测肝癌血清多肽标志物

建立免疫亲和富集分离与质谱分析相结合的免疫质谱法用于血清多肽标志物pep5的检测。多克隆抗体与蛋白A琼脂糖颗粒偶联用于捕获pep5,基质辅助激光解析电离飞行时间质谱检测标志物。本方法的线性范围为1～48 nmol/L,检出限0.2 nmol/L;回收率为93.0%～103.1%,相对标准偏差(RSD)为6.4%～11.8%;反复冻融3次pep5,检测结果稳定;检测临床肝癌/正常血清样本灵敏度为78.0%、特异度为90%。该方法方便、快速、准确,适用于临床样本中低浓度标志物的检测研究,对于癌症的早期诊断具有重要意义。     

新方法合成4-氰基-1-茚酮

以邻氰基氯苄和丙二酸二乙酯为原料,经缩合、碱水解、脱羧和Friedel-Crafts酰化反应合成了4-氰基-1-茚酮,总收率32.1%,其结构经1H NMR和13C NMR确证。     

乌头与贝母配伍化学成分变化的UPLC/Q-TOFMS研究

利用UPLC/Q-TOFMS对中药十八反药对——乌头贝母配伍的合煎液与合并液进行检测,经过MassLynx 4.1分析其化学成分存在差异,发现合煎后次乌头碱水解受到部分抑制,而其他主要的双酯型二萜生物碱溶出较少且水解较彻底,乌头与川贝配伍合煎的毒性相对较小,因而可能通过合理炮制减毒后应用于临床治疗.     

基于稳定同位素标记与质谱分析的蛋白质定量算法研究进展

蛋白质定量研究已成为蛋白质组学的热点,它是疾病相关生物标志物发现的重要途径.基于稳定同位素标记的质谱分析技术是蛋白质定量最常用的方法之一.随着实验方法的发展和改进,定量数据处理方法也在不断更新与完善.一般来说,定量数据处理包括四步:搜库鉴定、图谱定量信息提取与计算、肽段丰度比计算和蛋白质丰度比计算及差异显著性分析,其中后三步是数据处理的核心.目前,后三步中每步都有多种可选算法,这些算法一般都是针对特定实验技术而提出的,缺乏深入的工作对它们进行系统比较和优化.为此,在总结目前主要实验技术方法的基础上,论述了定量算法的现状和存在问题,并针对一些问题提出了可行的解决办法.     

用EM算法改进鸟枪法蛋白质鉴定中的无标记定量方法

蛋白质定量是探索疾病发生发展状况和寻找新药靶标的重要手段。在shotgun蛋白组学中,目前常用定量方法包括综合同位素标记后的质谱峰强度方法和无标记定量方法。根据数据类型无标记定量方法可以分为两类:基于鉴定蛋白的质谱数的方法和基于质谱峰强度的方法。本研究主要用EM算法改进基于鉴定蛋白质谱数的定量方法,并用免疫印迹实验获得的酵母全蛋白的丰度来验证EM算法改进后定量的有效性结果表明,改进后的质谱数和蛋白丰度的相关性比改进前有一定的提高。同时,利用这些数据对主要的几种基于鉴定蛋白的质谱数的模型进行了比较,发现PAI模型最好,SpS模型次之,emPAI模型最不适合于蛋白质定量。     

等电聚焦分离与18O稳定同位素标记联用的磷酸化蛋白质组学定量方法研究

磷酸化蛋白质组学定量分析,要对磷酸化修饰富集技术和定量技术进行研究。基于此,本研究采用18O稳定同位素标记技术对胰蛋白酶酶解肽段混合物进行标记,并对其标记时间和标记后胰蛋白酶的变性条件进行优化。结果表明:在pH=4～5的KH2PO4缓冲体系中,37℃,标记反应持续19～24h,除了C-端肽之外,几乎所有的肽段都可达到100%标记;采用TCEP可以有效地抑制16O-18O回标现象。建立了与18O标记技术兼容性良好的IPG-IEF技术对磷酸化肽段进行选择性富集,富集后共从HepG2细胞中鉴定到491个磷酸化位点、362个磷酸化肽段和356个磷酸化蛋白,表明IPG-IEF在大规模磷酸化肽段分离富集中是有效的;最后与高准确度高灵敏度高分辨率的LTQ-FTICR质谱仪联用,建立了基于18O-IPG-IEF-LTQ-FTICR的磷酸化蛋白质组定量技术。实验结果表明,该技术可以实现磷酸化肽段的有效定性和定量。本研究为磷酸化蛋白质组学定量研究提供了实用技术。     

自然对流情形下激光辐照液体贮箱的尺度律

根据质量守恒、动量守恒及能量守恒原理,建立了自然对流情形下激光辐照液体贮箱的理论模型。通过方程分析法,导出了该问题的尺度律,在此基础上给出了激光辐照液体贮箱的缩比方法,并对一组实例进行了数值计算,得到了缩比模型与原型结果完全相似的结论,模拟结果证明了该问题尺度律的成立。为验证理论模型与数值求解的正确性,本文还针对小尺度模型进行了实验研究,数值模拟结果与实验测量结果符合较好,表明理论模型可靠有效。     

基于ConA富集和LTQ-FT质谱鉴定的小鼠肝脏内质网N-糖蛋白质组研究

糖基化修饰是生物体内复杂和重要的蛋白质翻译后修饰方式之一.N-糖基化蛋白质在内质网中进行合成的过程中,所有的N-糖链都以甘露糖和葡萄糖结尾,而凝集素ConA对以甘露糖结尾的糖链有较高的亲和性,可以用来富集在内质网中合成的N-糖蛋白质.本文据此提出了一种基于内质网分离和凝集素ConA富集的复杂样品N-糖基化位点研究策略.通过使用高准确度的质谱线性离子阱-傅立叶变换回旋离子共振质谱对N-糖蛋白质进行鉴定,并对N-糖基化位点进行确定.我们采用模式生物C57BL/6J肝脏作为生物样本,在生物水平和质谱水平分别进行了3次重复,共鉴定了212个N-糖蛋白质的323个N-糖基化位点.在这些蛋白中,131个是Swissprot库中已确认的N-糖蛋白质.此方法富集的糖蛋白,糖型统一,有利于样品的分离和PNGaseF酶切作用,提高了鉴定的效率.对鉴定的212个N-糖蛋白质的定位和功能进行了分析,本文鉴定的N-糖蛋白质对现有的鼠肝N-糖蛋白质数据库进行了有效的补充.     

不同LET辐射致DNA集簇性损伤的研究

利用辐照质粒DNA构象变化的分子模型,以DNA糖苷酶Fpg和AP核酸内切酶EndoIII识别并切割辐射所致DNA碱基损伤,将其转换为DNA断裂损伤,通过电泳分析DNA分子构象变化,研究比较γ射线、质子和7Li离子诱发DNA集簇性损伤。50Gy以上高剂量γ辐射对质粒DNA的损伤主要表现为单链断裂(SSB)和很少比例的双链断裂(DSB),并能产生一定水平的集簇性损伤。相比之下,高能质子束和高LET的7Li离子直接所致DNA的断裂损伤以及所产生的集簇性碱基损伤比γ射线的要严重,质子10Gy照射就可诱发明显的集簇损伤。