新型双功能谷胱甘肽合成酶的真核和原核表达

通过裂解无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)菌体细胞得到基因组DNA。根据GenBank上已发表的无乳链球菌(菌种编号ATCC13813)新型双功能谷胱甘肽合成酶基因(gshF)的核酸序列与2种不同表达载体多克隆位点序列,分别设计引物F₁、R₁和F₂、R₂,再以总DNA为模板,经过特异性PCR扩增出长度约为2 200 bp的目的基因。随后分别对目的基因gshF和2种表达载体进行双酶切、连接等操作,得到表达载体pPIC9K-gshF与pET-gshF。用Sal I线性化表达载体pPIC9K-gshF后电转至毕赤酵母GS115中。经MD平板筛选重组子、菌落PCR鉴定阳性菌株、G418抗性梯度平板筛选多拷贝菌株,最终在4.0 mg·mL^-1 G418抗性平板上筛选出阳性菌株。用甲醇终浓度为2%的BMMY培养基诱导该阳性菌株表达,每隔12 h取样并添加甲醇,96 h后离心收集发酵上清,经SDS-PAGE蛋白电泳显示：在85 kDa处出现1条明显蛋白带,大小与预期GshF蛋白一致。重组菌BL21-pET-gshF用IPTG诱导表达,先在37 ℃下培养90 min,再加入IPTG至1 mmol·L^-1后诱导7 h,离心收集表达产物并对重组菌进行超声破碎处理后,进行SDS-PAGE蛋白电泳,同样在85 kDa处有1条蛋白带。采用Bradford法测定2种表达产物上清的蛋白量,其中重组酵母表达上清中蛋白量为0.46 mg·mL^-1,重组大肠杆菌表达产物破壁后的蛋白量为1.46 mg·mL^-1。测定并比较2种不同表达方式所得酶活,发现GshF在毕赤酵母表达中的比酶活仅为14.15 U·mL^-1,经原核表达后比酶活可达62.15 U·mL^-1。     

新型双功能谷胱甘肽合成酶的真核和原核表达

通过裂解无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)菌体细胞得到基因组DNA。根据GenBank上已发表的无乳链球菌(菌种编号ATCC13813)新型双功能谷胱甘肽合成酶基因(gshF)的核酸序列与2种不同表达载体多克隆位点序列,分别设计引物F₁、R₁和F₂、R₂,再以总DNA为模板,经过特异性PCR扩增出长度约为2 200 bp的目的基因。随后分别对目的基因gshF和2种表达载体进行双酶切、连接等操作,得到表达载体pPIC9K-gshF与pET-gshF。用Sal I线性化表达载体pPIC9K-gshF后电转至毕赤酵母GS115中。经MD平板筛选重组子、菌落PCR鉴定阳性菌株、G418抗性梯度平板筛选多拷贝菌株,最终在4.0 mg·mL^-1 G418抗性平板上筛选出阳性菌株。用甲醇终浓度为2%的BMMY培养基诱导该阳性菌株表达,每隔12 h取样并添加甲醇,96 h后离心收集发酵上清,经SDS-PAGE蛋白电泳显示：在85 kDa处出现1条明显蛋白带,大小与预期GshF蛋白一致。重组菌BL21-pET-gshF用IPTG诱导表达,先在37 ℃下培养90 min,再加入IPTG至1 mmol·L^-1后诱导7 h,离心收集表达产物并对重组菌进行超声破碎处理后,进行SDS-PAGE蛋白电泳,同样在85 kDa处有1条蛋白带。采用Bradford法测定2种表达产物上清的蛋白量,其中重组酵母表达上清中蛋白量为0.46 mg·mL^-1,重组大肠杆菌表达产物破壁后的蛋白量为1.46 mg·mL^-1。测定并比较2种不同表达方式所得酶活,发现GshF在毕赤酵母表达中的比酶活仅为14.15 U·mL^-1,经原核表达后比酶活可达62.15 U·mL^-1。     

浙江大戟科植物新资料

报道了在浙江大戟科Euphorbiaceae植物分类研究中的新发现：（1）经考证，文献记载浙江产的倒卵叶算盘子Glochidion obovatum Siebold et Zucc.系台闽算盘子G.rubrum Blume的误定；通奶草Euphorbia indica Lam.系细齿大戟E.bifida Hook. & Arn.的误定；小叶地锦E.heyneana Spreng.系小叶大戟E.makinoi Hayata的误定；毛果算盘子G.eriocarpum Champ.ex Benth.和革叶算盘子G.daltonii (Müll.Arg.) Kurz.在浙江无自然分布。（2）赞同将黄算珠树G.fortunei Hance作为台闽算盘子G.rubrum Blume的异名；考证了卵叶石岩枫Mallotus repandus (Willd.) Müll. Arg.var.scabrifolius (A.Juss.) Müll.Arg.、白背叶Mallotus apelta (Lour.) Müll.Arg.和野桐M.tenuifolius Pax.的学名，将黄背野桐M.tenuifolius Pax var.subjaponicus Croizat作为日本野桐M.japonicus (L.f.) Müll.Arg.的新异名。（3）毛枝叶下珠Phyllanthus glaucus Wall.ex Müll.Arg.var.trichocladus P.L.Chiu ex Z.H.Chen为新变种；苦味叶下珠Phyllanthus amarus Shumach.et Thonn.、药用黑面神Breynia officinalis Hemsl.为浙江分布新记录种。     

浙江大戟科植物新资料

报道了在浙江大戟科Euphorbiaceae植物分类研究中的新发现：（1）经考证，文献记载浙江产的倒卵叶算盘子Glochidion obovatum Siebold et Zucc.系台闽算盘子G.rubrum Blume的误定；通奶草Euphorbia indica Lam.系细齿大戟E.bifida Hook. & Arn.的误定；小叶地锦E.heyneana Spreng.系小叶大戟E.makinoi Hayata的误定；毛果算盘子G.eriocarpum Champ.ex Benth.和革叶算盘子G.daltonii (Müll.Arg.) Kurz.在浙江无自然分布。（2）赞同将黄算珠树G.fortunei Hance作为台闽算盘子G.rubrum Blume的异名；考证了卵叶石岩枫Mallotus repandus (Willd.) Müll. Arg.var.scabrifolius (A.Juss.) Müll.Arg.、白背叶Mallotus apelta (Lour.) Müll.Arg.和野桐M.tenuifolius Pax.的学名，将黄背野桐M.tenuifolius Pax var.subjaponicus Croizat作为日本野桐M.japonicus (L.f.) Müll.Arg.的新异名。（3）毛枝叶下珠Phyllanthus glaucus Wall.ex Müll.Arg.var.trichocladus P.L.Chiu ex Z.H.Chen为新变种；苦味叶下珠Phyllanthus amarus Shumach.et Thonn.、药用黑面神Breynia officinalis Hemsl.为浙江分布新记录种。     

浙江植物区系新资料（Ⅱ）

在编撰《浙江植物志》（新编）过程中，通过野外调查、模式标本检查、分类学文献研究等方法，在浙江种子植物分类方面取得了若干新发现。（1） 修订了5个植物分类群：将钟氏柳Salix tsoongii Cheng 改隶为粤柳的变种S. mesnyi var. tsoongii（Cheng） Z.H.Chen，W.Y.Xie et S.Q.Xu；将白花八角莲Podophyllum pleianthum var. album Masam.组合为Dysosma pleiantha （Hance） Woodson f. alba （Masam.） W.Y.Xie et D.D.Ma；将短毛紫荆Cercis chinensis Bunge f. pubescens C.F.Wei提升为变种C. chinensis Bunge var. pubescens （C.F.Wei） G.Y.Li et Z.H.Chen；恢复了落叶女贞Ligustrum compactum （Wall.ex G.Don） Hook.f. et Thomson ex Brandis var. latifolium Cheng的变种地位，将L.lucidum W.T.Aiton var. latifolium （Cheng） Cheng作为其新异名；肯定了钟氏蓟Cirsium tsoongianum Ling的种级地位，并将钟氏线叶蓟C. lineare （Thunb.） Sch.Bip.var. tsoongianum （Ling） Ling和杭蓟C. tianmushanicum C.Shih作为其新异名。（2） 描述了7个植物新分类群，其中，无毛黄山紫荆Cercis chingii Chun var. glabrata G.Y.Li et Z.H.Chen和无刺裸实Gymnosporia diversifolia Maxim.var. inermis Z.H.Chen et G.Y.Li为新变种；绿花三叶木通Akebia trifoliata （Thunb.） Koidz.f. dapanshanensis G.Y.Li et Zi L.Chen等5个为新变型。     

光滑函数实根计算的渐进显式公式

求根问题在计算机图形学、机器人技术、地磁导航等领域应用广泛。基于重新参数化方法（reparamaterization-based method，RBM），给出了用于计算给定光滑函数在某区间内唯一实根的渐进式显式公式。给定光滑函数f（t），用有理多项式A_i（s）对曲线C（t）=（t，f（t））进行插值，得到重新参数化函数t =?_i（s），使得A_i（s_j）=C（?_i（s_j））。提出了基于重新参数化函数?_i（s）的显式公式用于渐进式逼近f（t）对应的实根，在n个函数计算的成本下，收敛阶可达到3·2^n-2，其中n≥3。与类牛顿法相比，本文方法提高了计算稳定性，且收敛速度更快、计算效率更高。与裁剪法相比，本文方法不需要求解包围多项式，且可用于非多项式函数计算，计算效率更高。数值实例表明，每增加一个插值点，逼近阶可提高一倍，且可获得较传统裁剪法更高的计算效率。     

对风廓线雷达和L波段雷达探空观测的水平风场的一致性评估

利用浙江省2015—2018年萧山站风廓线雷达和杭州国家基准气候站L波段雷达探空资料，对这2种观测设备的水平风场一致性进行了评估。与以往评估方法不同的是，本文将气球向风廓线雷达方向漂移的廓线作为对照样本，以减少2种设备不同源同址以及探空气球非水平定向漂移对评估结果的影响。分析结果显示，在无降水条件下，高度在1~5.5 km时，风廓线雷达的水平风场与L波段雷达探空的水平风场一致性较好，且随高度变化差异不显著，2种观测，u分量的相关系数为0.95，平均绝对偏差和均方根误差分别为1.47和2.29 m·s^-1，v分量的相关系数为0.87，平均绝对偏差和均方根误差分别为1.52和2.12 m·s^-1；高度在1 km以下时，2种观测的u分量和v分量的相关系数均约为0.5，u分量和v分量的均方根误差均在2~8 m·s^-1，考虑近地层风的不稳定性，加之观测地相距较远，此评估结果可信度较低。此外，降水条件下的统计结果与无降水条件下的统计结果无显著差异。     

对风廓线雷达和L波段雷达探空观测的水平风场的一致性评估

利用浙江省2015—2018年萧山站风廓线雷达和杭州国家基准气候站L波段雷达探空资料，对这2种观测设备的水平风场一致性进行了评估。与以往评估方法不同的是，本文将气球向风廓线雷达方向漂移的廓线作为对照样本，以减少2种设备不同源同址以及探空气球非水平定向漂移对评估结果的影响。分析结果显示，在无降水条件下，高度在1~5.5 km时，风廓线雷达的水平风场与L波段雷达探空的水平风场一致性较好，且随高度变化差异不显著，2种观测，u分量的相关系数为0.95，平均绝对偏差和均方根误差分别为1.47和2.29 m·s^-1，v分量的相关系数为0.87，平均绝对偏差和均方根误差分别为1.52和2.12 m·s^-1；高度在1 km以下时，2种观测的u分量和v分量的相关系数均约为0.5，u分量和v分量的均方根误差均在2~8 m·s^-1，考虑近地层风的不稳定性，加之观测地相距较远，此评估结果可信度较低。此外，降水条件下的统计结果与无降水条件下的统计结果无显著差异。     

动物源性食品中地西泮残留量的检测方法研究

采用高效液相色谱法（HPLC）、气相色谱质谱联用法(GC-MS/MS)以及液相色谱质谱联用法(HPLC-MS/MS)测定动物源性食品中镇静剂类药物地西泮的残留量。将样品均质粉碎后,经乙腈提取,固相萃取小柱净化后上机检测,外标法定量。实验证明,当固相萃取的洗脱液中甲醇与乙酸溶液的体积比为70：30时,洗脱效率最高。在不同仪器条件下,地西泮在各自浓度范围内的线性关系良好,相关系数（r²）均大于0.999,回收率在84.6%~ 101.7%,相对标准偏差（RSD）在0.52%~9.44%（n=3）,检出限为0.5 μg·kg^-1（S/N=3,气相色谱质谱联用法以及液相色谱质谱联用法）和10.0 μg·kg^-1（S/N=3,高效液相色谱法）,定量限按照3倍检出限计算; 3种方法均可分析动物源性食品中的地西泮残留量。对比可知,质谱法灵敏度和准确率高,但有一定的基质效应;液相色谱法操作简单,几乎不受基质效应的影响,但灵敏度和准确率不如质谱法。     

动物源性食品中地西泮残留量的检测方法研究

采用高效液相色谱法（HPLC）、气相色谱质谱联用法(GC-MS/MS)以及液相色谱质谱联用法(HPLC-MS/MS)测定动物源性食品中镇静剂类药物地西泮的残留量。将样品均质粉碎后,经乙腈提取,固相萃取小柱净化后上机检测,外标法定量。实验证明,当固相萃取的洗脱液中甲醇与乙酸溶液的体积比为70：30时,洗脱效率最高。在不同仪器条件下,地西泮在各自浓度范围内的线性关系良好,相关系数（r²）均大于0.999,回收率在84.6%~ 101.7%,相对标准偏差（RSD）在0.52%~9.44%（n=3）,检出限为0.5 μg·kg^-1（S/N=3,气相色谱质谱联用法以及液相色谱质谱联用法）和10.0 μg·kg^-1（S/N=3,高效液相色谱法）,定量限按照3倍检出限计算; 3种方法均可分析动物源性食品中的地西泮残留量。对比可知,质谱法灵敏度和准确率高,但有一定的基质效应;液相色谱法操作简单,几乎不受基质效应的影响,但灵敏度和准确率不如质谱法。     

离子色谱法同时测定植物生长调节剂中氯化胆碱、甲哌鎓及N-甲基哌啶

建立了一种离子色谱-抑制电导同时测定植物生长调节剂中主要活性成分氯化胆碱、甲哌鎓以及杂质N-甲基哌啶的快速检测方法。 样品经稀释过膜后直接进样分析, 采用阳离子交换色谱柱thermo scientific ionpac CG17 （50 mm×4 mm） + CS17 （250 mm×4 mm）,以10 mmol·L^-1甲烷磺酸溶液等度淋洗,可在10 min内完成以上目标分析物的检测,且常规阳离子（Li⁺、 Na⁺、 NH₄⁺、 K⁺、 Mg²⁺和Ca²⁺）不会干扰对3种化合物的测定。 在优化后的最佳色谱条件下,氯化胆碱的线性范围为0.1~500 mg·L^-1,甲哌鎓的线性范围为0.5~500 mg·L^-1,N-甲基哌啶的线性范围为0.4~200 mg·L^-1,3种化合物线性相关系数（r）均大于0.999 4,线性关系良好。 3种目标分析物的检出限（信噪比S/N = 3）为28.0~112.5 μg·L^-1,定量限（信噪比S/N = 10）为93.5~375.0 μg·L^-1,峰面积的相对标准偏差（RSD, n = 6）均小于0.47%,表明方法具有较好的重现性。 该检测方法简单方便,已成功应用于商品化植物生长调节剂中3种成分质量浓度的测定,实际样品加标回收率为96.0%~103.6%。 可应用于相关植物生长调节剂原料及成品的质量控制。     

离子色谱法同时测定植物生长调节剂中氯化胆碱、甲哌鎓及N-甲基哌啶

建立了一种离子色谱-抑制电导同时测定植物生长调节剂中主要活性成分氯化胆碱、甲哌鎓以及杂质N-甲基哌啶的快速检测方法。 样品经稀释过膜后直接进样分析, 采用阳离子交换色谱柱thermo scientific ionpac CG17 （50 mm×4 mm） + CS17 （250 mm×4 mm）,以10 mmol·L^-1甲烷磺酸溶液等度淋洗,可在10 min内完成以上目标分析物的检测,且常规阳离子（Li⁺、 Na⁺、 NH₄⁺、 K⁺、 Mg²⁺和Ca²⁺）不会干扰对3种化合物的测定。 在优化后的最佳色谱条件下,氯化胆碱的线性范围为0.1~500 mg·L^-1,甲哌鎓的线性范围为0.5~500 mg·L^-1,N-甲基哌啶的线性范围为0.4~200 mg·L^-1,3种化合物线性相关系数（r）均大于0.999 4,线性关系良好。 3种目标分析物的检出限（信噪比S/N = 3）为28.0~112.5 μg·L^-1,定量限（信噪比S/N = 10）为93.5~375.0 μg·L^-1,峰面积的相对标准偏差（RSD, n = 6）均小于0.47%,表明方法具有较好的重现性。 该检测方法简单方便,已成功应用于商品化植物生长调节剂中3种成分质量浓度的测定,实际样品加标回收率为96.0%~103.6%。 可应用于相关植物生长调节剂原料及成品的质量控制。     

完全二部图K_(10,n)(215≤n≤466)的点可区别E-全染色

图G的一个E-全染色是指使相邻点染以不同的颜色,且每条关联边和它的端点染以不同的颜色的全染色。对图G的一个E-全染色f,一旦对图G中任意互不相同的两点u, v,有C(u)≠C(v),其中C(x)表示在f下点x的颜色以及与x关联的边的色所构成的集合,那么f称为图G的点可区别的E-全染色,简称为VDET染色。令χ_(vt)~e(G)=min{k|G存在k-VDET染色},称χ_(vt)~e(G)为图G的点可区别E-全色数。运用分析法和反证法,讨论并证明了完全二部图K_(10,n)(215≤n≤466)的点可区别E-全色数。     

蛋清溶菌酶基因的密码子优化及其在毕赤酵母中的分泌表达

作为一种天然的抑菌物质,溶菌酶对抗生素耐药菌有较强的杀伤作用，具有无耐药性、无残留等特点，被认为在诸如动物饲料、药品等领域可有效代替抗生素，改善滥用抗生素所引起的一系列问题，市场前景巨大。通过微生物发酵大规模生产重组溶菌酶符合市场发展趋势，由于目前生产的菌株表达量偏低，限制了溶菌酶的应用和产业化发展。为提高蛋清溶菌酶的发酵表达量，根据毕赤酵母密码子的偏爱性,对其编码基因进行密码子优化，并构建了真核分泌表达载体pPIC9K-coEWL，经遗传霉素G418抗性筛选后，获得了一株酵母转化子(G-p-coEWL)，其对G418的抗性浓度高达15 mg·mL^-1。在28℃、pH 6.0、转速240 r·min^-1和甲醇浓度1%的诱导条件下,酵母重组子G-p-coEWL经摇瓶培养72 h，实现了蛋清溶菌酶的分泌表达。在发酵上清液中，总蛋白浓度为 607 mg·L^-1，酶活达到677 U·mL^-1。此外，本实验还比较了葡聚糖凝胶柱Sephadex G-50和强酸性阳离子交换柱SP-Sepharose FF两种方法对目的蛋白的分离效果,得到 Sephadex G-50的分离效果更好，并在14.4 kDa处得到单一的溶菌酶条带。