人参叶全长cDNA文库的构建及部分克隆的序列分析

提取人参叶组织总RNA,用SMART[TM]cDNA文库构建试剂盒所示方法,以λTriplEx2为载体构建了人参叶cDNA文库.经测定该文库初始滴度为1.2×106pfu/mL,扩增后滴度为7.6×1010pfu/mL,重组率为86%.插入片段长度为0.3~2.5 kb.随机挑取16个cDNA克隆体进行测序分析,结果显示16个克隆体中有8个同GenBank中登录的人参皂苷合成相关基因GBR5,GBR3和GBR1高度同源,8个为新的基因序列.人参cDNA文库的建立为克隆人参中有明确功能的特异基因以及克隆和研究人参中的新基因奠定了必要的物质基础.     

马铃薯Y病毒基因组3′-端区域的克隆和序列分析

以马铃薯Y病毒(PVY,中国分离株)基因组RNA的cDNA为模板,我们用聚合酶连锁反应(PCR)合成了完整的外壳蛋白(CP)基因及部分3′末端非编码区序列。在5′-引物Y5中引入了限制性酶NcoI位点及起始密码AUG,3′-引物Y3中引入了Sall位点。PCR产物经NcoI及Sall双酶切后克隆入pGEM衍生质粒,并测定了其中一个克隆pPCY6的CP基因的序列,以此克隆的CP基因片段作探针,从cDNA库中钓出相关的几个克隆,并测定了序列,由此我们获得了包含部分NIb基因,全部的CP基因及3′-非编码区共1317个碱基。序列分析表明,该株系CP基因核苷酸序列与0株系同源性(94.2％)较与N株系(89.6％)同源性稍高,但氨基酸序列的同源性差别不大(分别为93.3％及91.8％)。目前我们已将该基因克隆入双元载体pBI121.1,并通过脓杆菌转化马铃薯,以期得到抗PVY的马铃薯工程株。     

双链特异性核酸酶的生物学和医学应用

双链特异性核酸酶DSN是一种能高选择性地识别并酶切完全匹配的DNA双链或者DNA-RNA杂交双链中的DNA,而对单链DNA和RNA几乎没有作用的核酸酶.DSN酶的上述特点使其在生物和医学等领域广泛应用,主要包括全长cDNA文库的均一化、单核苷酸多态性(SNP)检测和高通量测序等.近年来,DSN酶在microRNAs(miRNAs)的检测领域得以长足发展和应用.miRNAs是一组内源性、非编码短序列RNAs,在生理和病理过程中具有重要作用,但由于其序列短、丰度低等特点, miRNAs的检测一直是临床难题.新近研究主要基于DSN酶信号放大的特点,相继建立了一系列生物传感技术,通过采用不同检测原理如比色法、荧光法、电化学法等实现痕量miRNAs检测.本文就DSN酶在miRNAs检测、SNP检测、全长cDNA文库均一化及高通量测序等方面的生物学应用进行了综述.     

RNA生物标志物体外检测方法研究进展

RNA生物标志物主要包括编码蛋白的mRNA和非编码蛋白的microRNA (miRNA)、环状RNA (circula rRNA, circRNA)及长链非编码RNA (lncRNA)等.RNA生物标志物种类多,生物信息量丰富,相比DNA更能动态反映细胞生物学功能和调控过程,因此,RNA生物标志物的定量检测和表达分析对于细胞功能研究、疾病的诊断和治疗及预后监测等具有重要意义.本文重点介绍了常见RNA生物标志物mRNA、miRNA、circRNA和lncRNA体外检测方法的原理及研究进展,并对RNA生物标志物检测面临的挑战及发展趋势进行了展望.     

兔早期胚泡特异肽的cDNA克隆

从家兔受精后第6天(着床前)的早期胚泡构建cDNA文库,经阶段特异分子杂交筛选,克隆了仅在此时期表达的9种胚泡特异肽类的cDNA对其中一种丰度较高的cDNA克隆进行了研究,测出其编码区含有285碱基对,5'和3'侧翼区各有132和170碱基对.经DNA序列分析,推导出一种分泌性多肽的一级结构,由75个氨基酸组成.计算机分析显示它与迄今报道的所有基因和蛋白在结构上无任何同源性.     

乙型肝炎病毒表面抗原互补脱氧核糖核酸的分子克隆及检定

用特异性免疫沉淀法从一人肝癌细胞株(PLC/PRF/5)中浓集乙型肝炎表面抗原(HBsAg)信使核糖核酸(mRNA),制得互补脱氧核糖核酸(cDNA),进行克隆.用已克隆化的病毒探针进行原位杂交,检得一个含HBsAg cDNA的菌株.对它进行了限制性内切酶谱及核苦酸序列分析.该 HBsAg cDNA经~(32)P标记后与PLC/PRF/5细胞DNA和RNA分别进行分子杂交的结果,显示出整合入该宿主基因组中乙型肝炎病毒的拷贝至少有6个;含HBsAg特异序列的PNA有三种、本文对乙型肝炎病毒在原发性肝癌致癌基因中可能的作用进行了讨论。     

综合分析MicroRNA-mRNA相互作用预测中的特征重要性

MicroRNA是大约22个核苷酸的非编码RNA分子,在它的3'端有1～2个核苷酸的悬垂.在真核生物中,它因为影响信使RNA的翻译和稳定性而闻名,并涉及发育,分化,细胞调亡等各种生物过程~([1]).据报道有1/3的人类基因能被miRNA所靶定,且有证据证明它与很多癌症有直接或间接的联系.阶段特异性,组织特异性和相对小的表达量导致了它的复杂性,从而探索miRNA的奥秘成为一个非常重要且有挑战性的问题.     

基于非特异性蛋白酶连续酶解的蛋白质全序列测定方法

对蛋白质全序列进行测定, 有助于分析蛋白质的结构, 揭示蛋白质的生物学功能. 针对目前基于质谱的蛋白质测序流程中使用特异性蛋白酶酶解产生的肽段种类少、重叠度低、序列拼接困难等问题, 发展了一种基于非特异性蛋白酶连续酶解的蛋白质全序列测定方法. 构建了连续酶解装置, 并使用多种非特异性蛋白酶对蛋白质进行连续酶解. 利用非特异性蛋白酶酶解位点的非特异性、不同的酶解时间以及不同种类蛋白酶酶解产生肽段的互补性, 提高蛋白质酶解肽段的种类和重叠度, 并发展了蛋白质序列拼接算法对液相色谱质谱联用(LC-MS/MS)和从头测序获得的肽段序列进行拼接. 将此方法应用于牛血清白蛋白和单克隆抗体赫赛汀的全序列测定, 在不考虑亮氨酸和异亮氨酸的情况下, 对牛血清白蛋白和赫赛汀轻链的测序准确度达到100%, 赫赛汀重链的测序准确度为99.7%.     

miRNA在β_2受体激动剂作用中的研究进展

β_2受体激动剂的滥用威胁着消费者的人身安全,也制约着食品工业和畜牧业的发展,然而药物种类繁多,更新迅速,如何对其有效监测一直是研究的重点小分子RNA(miRNA)是近年来在真核生物体内发现的一类长度约22个核苷酸的内源性非编码单链RNA,主要通过与靶基因mRNA靶标区域的互补配对,发挥降解靶mRNA或抑制mRNA翻译的作用。它能参与多种生物学过程包括细胞凋亡、分化和癌变等。β_2受体激动剂类药物有着共同的作用机理,近年来的研究表明,miRNA的异常表达与β_2受体激动剂的使用密切相关。本文主要对与β_2受体激动剂作用机理相关的miRNA的研究进展展开综述,以期为实现对该类药物的有效监测提供参考。     

壳聚糖及其衍生物递送miRNA/siRNA的研究进展

微小RNA(microRNA,miRNA)和短链干扰RNA (small interfering RNA,siRNA)是两类具有调节基因表达功能的内源性非编码性小RNA分子.它们已成为多种疾病的潜在治疗药物,逐渐被应用于基因治疗中,而将小RNA应用于基因治疗亟需一种安全高效的递送载体.壳聚糖及其衍生物作为一种可降解、低...