高效抗虫转基因烟草的研究

苏云金杆菌HD-1的杀虫蛋白基因经5′端改造,3′端进行4种不同长度缺失后插入到含有双增强子的35S启动子,翻译增强子“Ω′”片段的双元载体中,借助土壤农杆菌LBA 4404将在此双元载体上的杀虫蛋白基因及新霉素磷酸转移酶基因(NPTII)转入到生产品种烟草NC89的染色体上,从而获得了抗卡那霉素的转化再生烟草植株。用1—3龄烟青虫对这些转化植株进行大量重复虫试结果表明用4种不同长度B.t.基因转化的再生植株中都有抗虫性高的植株,其中以1.8kb的B.t.Cry IA(c)基因转化的植株杀虫效果最好,这一组转基因植株的平均杀虫率在90—100％的约占该组总虫试植株的50％。对高抗虫性植株的子一代(T1)和子二代(T2)进行遗传分析,分子生物学分析和进一步的抗虫试验表明B.t.基因已遗传到子代并初步选到了高抗虫性的转基因纯合株系D8-14和D19-8等。     

苏云金芽孢杆菌杀虫基因导入中国栽培水稻品种中花11号获得转基因植株

在水稻的遗传转化中,迄今尚未见到将优良性状基因导入生产推广品种并获得转基因植株的报道。我们首次将B.t.杀虫基因导入到生产推广品种中花11号中,并建立了一套转导外源DNA的有效方法。应用剪掉内颖,同时去掉柱头保留完整外颖的方法可使种子结实率提高到50％。遗传转化植株经分子杂交实验室证实,B.t.杀虫基因已整合到水稻基因组中,得到了转杀虫基因水稻工程植株。用Jefferson的组织化学法测定转基因植株的β-glucuronidase的活性,与B.t.杀虫基因形成翻译融合的GUS基因得到了表达,这为B.t.杀虫基因在转基因水稻植株中的表达提供了证据。     

Azorhizobium caulinodans ORS571结瘤位点5(nod locus 5)的鉴定

用克隆的含A.caulinodans ORS 571 nodABC基因启动子区域(P_1)的800bp AccⅠ-pUC Ⅱ DNA做探针,在染色体上探测到另一个与P_1同源的8.4kb DNA片段,从ORS571 pLAFR1基因文库中分离到带有该片段的克隆子pRG90,8.4 kb DNA的内切酶图谱分析及DNADNA杂交实验表明同源区(P_2)位于450bp SmaⅠ-SphⅠ片段内。用Ω因子对8.4 kb DNA进行缺失插入突变,鉴定出一个使S.rostrata结瘤延迟的突变株ORS571-5。该突变株结瘤延迟的表型可由pRK84质粒(nod locus 5)互补。     

分子信标探针荧光法测定慢性粒细胞性白血病相关基因

根据慢性粒细胞性白血病(CML)相关基因b3a2序列设计了一种带有荧光基团和淬灭基团的凸环结构探针(分子信标,MB),研究其与互补目标DNA杂交前后的荧光变化行为,建立了b3a2基因检测的新方法.在最适条件下,得到杂交后溶液荧光强度与本底荧光强度的比值(S/B)和目标DNA 的浓度呈线性关系,r=0.9973,线性范围4.0×10-9～3.2×10-8 mol/L.该方法为实际样品的检测奠定了基础.     

用子房注射法将Bt毒蛋白基因导入玉米的研究

本文在国内外首次报道了用子房注射的方法将Bt毒蛋白基因导入玉米自交系的全过程。获得的一株转基因玉米(T_0)自交留种,得到了71株T_1代的植株。转基因玉米(T_0)经点渍法、Southern吸印/分子杂交以及PCR扩增均获得阳性结果;用T_1代植株叶片DNA进行PCR扩增,在71株中有7株呈阳性反应;对其中4株进行抗玉米螟测试,呈现一定的抗虫效果;在海南岛用农大60玉米再次进行子房注射,也获得了成功,说明这种方法是可重复的,从而为利用基因工程技术改造玉米开拓了新的途径。     

苏芸金杆菌蜡螟亚种(Bacillus thuringiensis subsp. galleriae)(H5ab)δ-内毒素基因的克隆和表达

本文通过分子杂交得到阳性克隆FG2,带有8.5kb的Barn HI和Sal I插入片段,经western blot分析表明此重组子表达了130kD和68kD的δ-内毒素蛋白,能与HD-1的δ-内毒素抗血清反应,同时对2—3龄的玉米螟进行了生物活性测定,证明有毒杀活力。本工作首次报道了苏芸金杆菌蜡螟亚种(H5ab)的δ-内毒素基因在大肠杆菌中的克隆和表达,同时为δ-内毒素基因在130Md质粒上的定位提供了直接证据。     

基于锁核酸探针的传感器用于BCR/ABL融合基因检测的研究

基于慢性粒细胞白血病中BCR/ABL融合基因的碱基序列,设计了一种新型发夹结构锁核酸(locked nucleic acids, LNA)探针,把LNA探针通过Au-s键固定在金电极表面构建了特异的生物传感器.LNA探针与目标链DNA杂交,以自行合成的苯甲酸二聚铜配合物([Cu2(C7H5O2)4(C2H6O)2], 简称[Cu(R)2]2+)为杂交指示剂,应用差示脉冲伏安法进行检测,表现出良好的响应信号.该新型锁核酸传感器能较好的区分完全互补链DNA、单碱基错配链DNA.对互补链DNA检测的线性范围为1.0×10-8～1.0×10-6 mol•L-1,检出限为2.0×10-9 mol•L-1.     

海洋来源真菌Penicillium brevicompactum OUCMDZ-4920的活性产物研究

通过化学与生物活性相结合的集成筛选方法,从海底沉积物样品(-68 m)中分离得到一株霉酚酸的产生菌短密青霉菌(Penicillium brevic Bompactum OUCMDZ-4920).从其寡营养发酵产物中分离获得了包括8个霉酚酸类化合物在内的11个化合物,其中外消旋的brevicolides A(1)和B(2)为新化合物.通过光谱分析、电子圆二色谱(ECD)、化学转化、手性拆分和Mosher反应,将其结构依次鉴定为(2'S,3'R)-(-)-brevicolide A(1a)、(2'R,3'S)-(+)-brevicolide A(1b)、(2'S,3'S)-(-)-brevicolide B(2a)、(2'R,3'R)-(+)-brevicolide B(2b)、霉酚酸(3)、3-羟基霉酚酸(4)、(S)-2-甲基-4-[5-羟基-7-甲氧基-4-甲基-1-氧亚基-6-(1,3-二氢异苯并呋喃基)]丁酸(5)、norpestaphthalides A(6)和B(7)、5,7-二甲氧基-4-甲基异苯并呋喃-1(3H)-酮(8)、6,8-二羟基-3-羟甲基-1H-异苯并吡喃-1-酮(9)、brevianamides A(10)和E(11).化合物3对小鼠白血病细胞P388、人口腔上皮癌细胞KB、人结直肠癌细胞HT29、人乳腺癌细胞MCF-7和人肺癌细胞A549表现出较好的抑制活性,IC50值为0.4~5.29μmol·L~(-1),对白色念珠菌表现出较好的抗真菌活性,最小抑菌浓度(MIC)为4.7μmol·L~(-1).合成了4个新化合物(-)-7-O-methylbrevicolide A(12a)、(+)-7-O-methylbrevicolide A(12b)、(-)-7-O-methylbrevicolide B(13a)和(+)-7-O-methylbrevicolide B(13b).     

人原发性肝癌及7402细胞株和髓细胞白血病细胞株(K562)的癌基因(转化基因)的共同属性——N-ras基因

用人的原发性肝癌(PHC)、肝癌7402细胞株(郭婵等,1984)及髓细胞白血病K562细胞株的DNA转染的NIH/3T3转化株DNA,以Southern吸印和~(32)P-标记的癌基因探针做分子杂交来分析,结果如下:在PHC DNA转化的NIH/3T3细胞DNA中,鉴定有N-ras基因的7.2及9.0kb(EcoRI酶切)的带,与人白细胞和肝癌DNA中出现的专一性条带相同,但是没有人Ha-ras(BamHI 6.6kb)或Ki-ras(EcoRI 3.0kb)的专一性条带。在以7402及K562细胞株DNA转化的细胞DNA中,同时发现有人的N-ras和Ha-ras基因(6.6kb,BamHI酶切),人的Ki-ras特异片段(3.0kb,EcoRI酶切)没有被检测到。PHC的DNA中N-ras基因在带型及杂交强度上没有大的改变,由于N-ras基因(非Ki-ras,Ha-ras)的表达,在多数PHC中明显地增加,提示了N-ras至少是人肝癌的转化基因之一。     

苏云金芽胞杆菌含不同质粒和不同基因工程菌的生长代谢

用微量热法研究了世界上产量最大的微生物杀中心剂苏云芽胞杆菌(Bacillusthuringiensis)野生菌株YBT－1463,无晶体突变株BMB160和无质粒、无晶体突变株BMB171以及含量不同杀虫蛋白基因工程菌BMB－304－171－A和BMB－304－171－B的生长代谢动力学变化。结果是,含有14个质粒的野生菌株YBT－1463的生长代谢热比无晶体含6个质粒的变株BMB160和无晶体、无质粒突变株BMB171低;将杀虫晶体蛋白基因vryⅠAc和cryⅠC分别转入受体菌BMB171中后,两个工程菌BMB－303－171－A和BMB－304－171－B生长代谢热与受体菌BMB171相比也吸显降低;表明质粒形成一个耗能过程,当受体菌BMB171转入杀虫晶体蛋白基因后,工菌比受茶杯菌的放热大幅度减少,表明基因编码杀虫晶体蛋白也是一个耗能过程,但是含基因cryⅠAc和cryⅠC工程菌BMB－304－171－A和BMB－304－171－B之间的生长代谢没有明显差异。首次报道这些热动力学变化,对杀虫剂发酵生产过程的代谢控有重要指导意义。