甲基化作用增强了盐效应对M.L.DNA大分子构象的影响

本文用Hha I DNA甲基化酶为工具酶,制备了甲基化水平为2.39％的Micrococcus luteus DNA(天然的M.L.DNA是完全未甲基化的)。又以CD光谱、UV光谱及微量热法等手段,比较了甲基化和未甲基化的M.L.DNA在不同MgCl_2浓度下的[θ]值、A值及释热值的变化。发现随着MgCl_2浓度的增加,两种M.L.DNA的[θ]_(275)值均减少;而—[θ]_(220-250)值加大;A_(260)值则呈明显的减色效应;释热值却相应增加。这都说明MgCl_2的作用使M.L.DNA大分子在空间上趋于缩拢,且这个过程均持续约10min。同时发现:甲基化水平为2.39％的M.L.DNA对MgCl_2效应的敏感性要比末甲基化的M.L.DNA高50—70倍。     

液相色谱-串联质谱法测定生物样本全基因组DNA甲基化

建立了基于液相色谱-电喷雾串联质谱的分析方法,对生物样本中全基因组DNA甲基化水平进行定量测定.首先将DNA从生物样本中提取出来,将DNA片段酶解为单核苷,利用液相色谱-串联质谱测定胞嘧啶核苷和5-甲基胞嘧啶核苷的含量,从而计算出其全基因组DNA甲基化率.利用该法研究了暴露于全氟辛烷磺酸的L-02细胞、10例原发性肝癌病例血浆样本和10例对照血浆样本的全基因组DNA甲基化水平,得出了它们的总甲基化率变化的初步结果.本方法操作简单,具有很高的灵敏度和稳定性,为研究生物样本,尤其是临床上易得但DNA含量极低的血浆样本的总甲基化水平提供了思路.     

表皮生长因子对DNA甲基化影响的研究

本文利用高效液相色谱层析(HPLC)方法和Southern印迹杂交技术分析了EGF对NC3H10和TC3H10两种细胞的基因组DNA和c-fos原癌基因甲基化水平的影响。结果表明,在EGF的持续作用下,细胞的基因组DNA和c-fos原癌基因甲基化水平明显下降。这些结果为阐明EGF对基因表达的调控机理提供了新线索。EGF诱导的DNA的低甲基化在肿瘤发生与发展中有无作用尚待进一步研究。     

蚕豆幼叶细胞核RNA聚合酶的研究

本文证明由蚕豆幼叶分离的细胞核具有很高的RNA聚合酶活力,可做为分离纯化RNA聚合酶的方便来源.细胞核在高浓度硫酸铵溶液中解体,超声处理释放出RNA聚合酶,然后用DEAE-cellulou和DEAE-Sephadex依次分部,或单独使用DEAE-Sephadex分部,得到了3个活力峰,根据层析性质和对α-鹅膏?肽的敏感性,它们相当于 RNA聚合酶Ⅰ,Ⅱ和Ⅲ.二价金属离子 Mn或 Mg为酶活力所必需.Ⅰ和Ⅱ酶的最适Mn离子浓度为3mM,最适Mg离子浓度为mM.小牛胸腺DNA和蚕豆DNA具有相同的模板活力。     

基于高效液相色谱的喹啉类药物对刺参DNA甲基化水平的影响研究

建立了高效液相色谱/紫外法测定刺参组织全基因组DNA甲基化水平的方法,并运用此方法对喹噁啉药物处理过的刺参样品DNA甲基化水平进行分析。色谱条件为:色谱柱为ZORBAX SB-Aq(4.6 mm×250mm;5μm);柱温为30℃;检测波长为280 nm;进样量20μL;流动相为甲醇-7 mmol/L乙酸铵(7∶93),流速为1.0 mL/min。5-甲基脱氧胞苷和脱氧胞苷的质量浓度在0.05~1.0 mg/L范围内时,线性关系良好,相关系数(r)均为0.999 9。5-甲基脱氧胞苷和脱氧胞苷的检出限均为0.05 mg/L,在加标浓度为0.05,0.25,1.0 mg/L时,回收率为90.4%~100.6%,批内、批间相对标准偏差均小于4%。采用CTAB法提取刺参组织DNA,酶解后进行HPLC测定,结果表明:喹噁啉药物处理过的组织样品DNA甲基化水平低于对照组,该类药物通过改变DNA甲基化水平而影响基因的正常表达,可能是其产生遗传毒性的一种机制,建立的方法可以很好地用于全基因组DNA总甲基化水平的检测。     

污染水产去甲基化表观遗传毒性EGFP评价方法

pEGFP-C3质粒经过体外人工甲基化处理后,被转染进入HepG2细胞以构建重组细胞株．以5-AZA为阳性去甲基化毒物与重组细胞共培养,通过亚硫酸氢钠测序法定量检测EGFP基因启动子区甲基化状态,通过实时定量PCR检测EGFP基因表达,借助流式细胞术和荧光摄片定量检测共培养细胞的绿色荧光强度,在DNA甲基化、EGFP基因mRNA表达、GFP蛋白等多个层次研究5-AZA染毒处理与其去甲基化能力和荧光表达改变的响应关系．对天津污染水产的去甲基化能力进行了实际样品测试．结果表明,5-AZA与重组细胞的DNA甲基化、基因表达、蛋白产物变化之间存在显著关联,具有较低的检出浓度和良好的重复性．天津污染海域的水产去甲基化能力较强．本文初步建立了一种污染物去甲基化表观遗传毒性评价方法．     

HL-60细胞DNA甲基化酶的纯化和性质

通过将HL-60细胞移植到裸鼠体内获得实体肿瘤。以此为材料确立了一个简便的提纯DNA甲基化酶程序,它包括:细胞的超声破碎、超离心、去核酸、硫酸铵盐析、DEAE-纤维素柱层析及Sephadex G100凝胶过滤。用梯度-PAGE得到一条电泳均一的区带,测得该酶的分子量为479kD,该酶的最适pH为8.2,对钾、钠离子敏感,对热不稳定;用L-B作图法测得其对底物S-腺苷酰-L-甲硫氨酸(SAM)的K_m为2.94×10~(-5)mol/L;SAH是该酶的竞争性抑制剂。在1mmol/L S-腺苷酰-L-高丰胱氨酸(SAH)存在下,其K_i为4.17×10~(-4)mol/L,同时也测定了该酶对DNA底物的专一性及几种代谢相关物对该酶的调节作用。     

白菜DNA甲基化水平的反相离子对高效液相色谱法研究

建立了反相离子对液相色谱测定白菜的DNA甲基化水平的方法。采用的色谱柱为HypersilBDSC18柱(200mm×4.0mm,5μm),以pH4.0的甲醇-5mmol·L-1庚烷磺酸钠-三乙胺(10:90:0.2,体积比)的混合液为流动相,UV检测器波长为273nm。通过测定DNA水样所产生的胞嘧啶和甲基胞嘧啶的含量,即可得知DNA甲基化程度。胞嘧啶和甲基胞嘧啶回收率分别为99.6%及103.3%,RSD为3.7%(日内)及5.2%(日间)。     

发夹型荧光分子探针用于DNA甲基化酶的活性分析及其在药物筛选中的应用

报道了一种基于发夹型荧光探针的甲基化酶活性的分析方法, 甲基化酶和相应的限制性内切酶的识别位点被设计在发夹型探针的茎部, 四甲基罗丹明(TAMRA)被连接在探针的5'端, 其荧光被连在3'端的熄灭基团4-(4'-二甲基对胺基偶氮苯)苯甲酸(DABCYL)所熄灭. 限制性内切酶可切割未发生甲基化修饰的探针, 导致探针的发夹结构遭到破坏, 引起TAMRA荧光信号的恢复. 根据荧光信号的恢复程度可实现对甲基化酶活性的分析. 在此基础上, 建立了一种简便、快速分析抗肿瘤药物对DNA甲基化酶活性的影响的方法, 为筛选针对基因甲基化异常引起的恶性肿瘤的治疗药物提供了一种新的思路和方法.