利用互补核酸杂交富集金胶实现信号扩增的电化学凝血酶蛋白生物传感器研究

介绍了一种利用互补核酸杂交富集金胶实现信号扩增的蛋白质生物传感器. 以凝血酶蛋白为研究对象, 利用凝血酶蛋白相对应的两段核酸适配体, 将适配体Ⅰ固定在磁性颗粒上, 用于特异性地捕获蛋白, 将适配体Ⅱ标记金胶作为检测信标. 由凝血酶蛋白和相对应的两段核酸适配体构建三明治结构的凝血酶蛋白生物传感器. 另外, 再通过信标金胶上过剩的核酸适配体链与另一段标记有金胶的互补核酸进一步杂交, 获得金胶的选择性聚集, 实现了信号扩增. 通过信号扩增, 使此传感器的灵敏度大大提高, 对凝血酶蛋白的检测下限可达到4.52×10-15 mol/L. 平行测定浓度为7.47×10-14 mol/L的凝血酶8次, 其RSD为3.0%. 该生物传感器对凝血酶蛋白有很好的特异性, 其它蛋白如溶菌酶和牛血清白蛋白的存在对于检测没有影响.     

基于双重猝灭原理的分子信标定量检测凝血酶

利用G碱基和有机猝灭基团对荧光基团的双重猝灭作用构建了分子信标,建立了一种基于双重猝灭原理的检测凝血酶的简单方法.此分子信标中荧光基团设计为羧基荧光素(FAM),有机猝灭基团设计为Black Hole Quencher 1(BHQ-1),BHQ-1连接3个含有G碱基的核苷酸,分子信标的环设计为凝血酶的核酸适配体.体系中没有凝血酶时,分子信标呈茎环结构,荧光基团FAM与有机猝灭基团BHQ-1及G碱基相互靠近,FAM的荧光在BHQ-1及G碱基的双重猝灭下,其荧光信号很弱;当体系中有凝血酶存在时,分子信标与凝血酶特异性结合,形成G-四联体结构,茎-环结构被破坏,FAM远离猝灭基团BHQ-1及G碱基,其荧光得到恢复.在最适条件下,体系的荧光强度(△I)与凝血酶的浓度(C)在0.4~40 nmol/L范围内具有良好的线性关系,线性回归方程为△I=24.63C(nmol/L)+13.06(R2=0.9972),检出限为0.18 nmol/L(3σ,n=9).实际血样加标回收率为96.3%~98.7%.     

采用纳米金和荧光标记的适配体检测凝血酶

将荧光染料分子标记的含29个碱基的可识别凝血酶的DNA适配体非特异吸附到纳米金表面,荧光发生猝灭,加入凝血酶后,凝血酶与适配体特异性结合,使适配体空间结构发生改变,荧光染料分子远离纳米金表面,荧光恢复,因此可以实现对凝血酶的检测。实验结果表明,这种检测方法简便、快速、特异性强,检出限为0.54 nmol/L(对应样品体积为200μL)。     

基于核酸适配体的荧光法检测水胺硫磷和丙溴磷

建立了基于适配体的农药水胺硫磷和丙溴磷的荧光检测方法.采用可特异性识别水胺硫磷和丙溴磷、且5 '端标记荧光基团FAM的核酸适配体(F-ssDNA),与3 '末端标记猝灭基团DABCYL的短链序列(Q-ssDNA)互补杂交形成双链结构,荧光基团的荧光被淬灭,荧光信号很弱;此时加入靶分子,特异性结合核酸适配体,引起互补短链序列从双链结构中解离,使适配体荧光信号增强,基于此可实现水胺硫磷、丙溴磷的定量检测.优化后的检测条件为:将终浓度为25 nmol/L F-ssDNA与50 nmol/L Q-ssDNA在25℃孵育20 min,使二者杂交形成双链适配体探针复合物,加入等体积的农药样品孵育60 min,然后检测体系的荧光信号变化值△I.在最佳条件下,△I与水胺硫磷和丙溴磷的浓度均在50～ 500 μmol/L范围内呈线性关系.水胺硫磷的检出限(LOD,3σ)为11.4 μmol/L,相对标准偏差(RSD)为5.8％(n=10);丙溴磷的检出限为14.0 μmol/L,RSD为4.9％(n=l0).用于实际水样中两种农药的检测,加标回收率为85.8％ ～95.3％.     

核酸适配体识别-荧光法检测赭曲霉素A

建立了核酸适配体识别-荧光探针技术检测赭曲霉素A(OTA)的新方法.基于微孔板上固定的核酸适配子与目标物质OTA结合时构象发生变化,导致预先与其互补杂交的FAM标记短链DNA解离,引起荧光信号发生变化,据此可实现对OTA的定量检测.当微孔板包被亲和素浓度为25 mg/L、适配子浓度为50 nmol/L,FAM标记互补短...     

基于核酸适配子识别的荧光法检测可卡因

基于荧光标记和核酸适配子识别可卡因,建立了简单、灵敏的可卡因新型荧光分析法.在微孔板表面组装亲和素-生物素化可卡因适配子-FAM标记可卡因适配子互补短链复合物,根据加入可卡因前后荧光强度的变化来定量可卡因.实验考察了微孔板包被亲和素浓度、生物素标记适配子用量、FAM标记可卡因适配子互补短链用量、反应温度、反应时间等因素...     

基于微磁珠分离技术的适配体实时定量PCR检测方法

利用适配体的识别能力和可扩增性, 构建了基于微磁珠分离技术的适配体实时定量聚合酶链式反应(PCR)检测方法. 通过微磁珠偶联的互补链与适配体序列之间的碱基配对结合, 有效除去溶液中未与靶分子结合的适配体序列, 采用实时定量PCR技术测定上清液中结合态的适配体序列浓度, 从而间接实现对靶分子的定量检测. 分别选取代表生物大分子和有机小分子的凝血酶和ATP作为检测对象, 验证了该方法的普适性. 研究结果表明, 在获取特异性适配体序列后, 仅需简单优化其互补链序列, 即可对超低含量的凝血酶和ATP进行准确定量, 检出限分别为50 pmol/L和5 μmol/L. 该方法具有同时适用于高特异性和高灵敏度地检测生物大分子和有机小分子的优势.     

基于主客体竞争模式的凝血酶适配体传感器的研究

基于β-环糊精(β-CD)主客体竞争模式,构建了开关型凝血酶适配体电化学传感器.将末端修饰了二茂铁(Fc)的核酸适配体通过与β-CD的主客体识别固定在金电极表面,当凝血酶存在时,适配体由原来的直立线状构型变为"G-四链体",远离电极表面,适配体探针的氧化还原电流强度减小,即"Signal-off".利用此效应对凝血酶进行了灵敏检测,结果表明,在5.0×10-13~5.0×10-9 mol/L浓度范围内,凝血酶的浓度与电化学响应信号呈良好的线性关系,检出限为2.0×10-13 mol/L(3σ).与其它蛋白分子相比,本方法对凝血酶蛋白的检测具有高特异性.本传感器构建简单,再生性好,为生物血清样本中凝血酶的实时高效检测提供了方法.     

基于适配体亲和毛细管电泳-激光诱导荧光检测的凝血酶分析

以一种高亲和力适配体作为亲和荧光探针,以自建的毛细管电泳-激光诱导荧光(CE-LIF)检测装置为基础,建立了一种高灵敏、快速测定人凝血酶的方法。荧光标记的凝血酶适配体特异性地与凝血酶结合并形成稳定的凝血酶-适配体复合物,采用CE-LIF对复合物进行分离检测,从而测定凝血酶浓度。探讨了盐离子种类及浓度对适配体与凝血酶结合的影响,并在选定的电泳条件下对凝血酶检测的线性范围、检出限和重现性进行了测定。结果表明,盐离子存在的条件下适配体与凝血酶的亲和力降低,不利于两者的结合;人血清溶液中,凝血酶浓度在0.25～10 nmol/L范围内与复合物峰面积具有良好的线性相关性(r20.991),检出限(S/N3)为55.6 pmol/L;精密度和回收率测定结果均能满足分析的要求。     

基于无标记的核酸适配体荧光生物传感器检测凝血酶

设计了一个简单、通用、基于核酸适配体无标记的高敏感、高专一检测凝血酶的荧光方法。以无标记凝血酶核酸适配体单链DNA为识别元素,Pico Green染料传导互补双链的荧光信号。Pico Green是一种不对称菁,当其单独存在时不产生荧光信号,而当其被吸附到互补的双链DNA上时,可产生很强的荧光信号,但被吸附到单链DNA上时,却无明显的信号改变。基于该性质,将其用于凝血酶的检测。该方法对凝血酶的响应线性范围为1.0×10~(-14)~1.0×10~(-7)mol/L,相关系数(r~2)为0.99,检出限为1.0×10~(-14)mol/L。1.0×10~(-8)mol/L两种干扰物质(牛血清蛋白和细胞色素C)的存在不影响凝血酶的检测,表明该方法对凝血酶具有非常好的专一性。该方法成功应用于对人血清样品的检测,其平均回收率为97%~102%。方法可简单、灵敏、特异性地检测凝血酶,有望用于医学临床诊断等领域。     

结晶紫光谱探针法无标记检测Pb~(2+)的DNA生物传感器

基于Pb~(2+)与凝血酶适配体(Thrombin Aptamer,TBA)特异性结合,以及结晶紫(CV)与凝血酶适配体、G-四链体结合后荧光信号的差异,建立了一种简单、灵敏、无需标记检测Pb2+的DNA生物传感器。实验研究了不同浓度的Pb~(2+)引起CV/TBA体系荧光强度变化的规律,考察了DNA序列、TBA与CV浓度比,以及稳定时间等因素对检测灵敏度的影响。实验结果表明:大多数金属离子无明显干扰,在最优实验条件下,Pb~(2+)浓度在5~50nmol/L范围内与体系荧光强度的变化呈良好的线性关系(r=0.9984),检测限(S/N=3)为2.0×10~(-9) mol/L。     

核酸适配体介导的荧光铜纳米簇用于免标记快速检测水胺硫磷

基于核酸适配体的靶标识别能力和铜纳米簇（CuNCs）优良的荧光性能,本研究开发了一种免标记荧光探针用于有机磷农药水胺硫磷（ISO）的快速检测。当靶标分子ISO不存在时,溶液中ISO的核酸适配体和互补DNA形成双链结构,从而介导合成荧光CuNCs,表现出高的荧光信号;当待测样品中存在ISO时,ISO与其核酸适配体形成复合物,释放出单链互补DNA。游离的单链DNA不能介导合成CuNCs,导致溶液中的荧光信号减弱。在最佳条件下,检测体系的荧光抑制率与ISO浓度的对数在0.05～25 mg/L浓度范围内呈线性关系,检出限为47μg/L (3σ),其它物质对其检测几乎没有干扰。将此探针用于检测水样中的ISO,回收率为80.3%～108.0%。研究结果表明,本方法可用于检测实际样品中的ISO残留。     

基于磁性辅助的杂交链反应放大检测三磷酸腺苷

本文提出了一种基于磁性辅助的杂交链反应放大检测三磷酸腺苷(ATP)的传感策略。磁性纳米粒子表面易于修饰,而且操作方便,具有很好的分离效果,能够提高生物传感的选择性。首先,利用生物素与链霉亲和素之间的亲和力作用,将生物素标记的ATP核酸适配体连接到链霉亲和素修饰的磁性纳米粒子表面,加入与ATP核酸适配体互补的一段DNA进行杂交,通过磁性分离除去未杂交上的DNA,加入靶向ATP,ATP与其适配体特异性结合将适配体的互补链通过磁性分离出来,磁性分离出的信号DNA继续用于下一步的杂交链反应,将信号放大,最后利用氧化石墨烯(GO)对荧光的猝灭效应降低背景荧光,达到高灵敏度、高选择性检测靶向ATP。其中,ATP的最低检测浓度为0.1nmol/L。     

基于计时库仑技术的可再生型三磷酸腺苷适配体电化学传感器的研究

构建了一种可再生型三磷酸腺苷(ATP)适配体计时库仑电化学传感器.将一条短链DNA通过AuS键自组装固定在电极表面, ATP的核酸适配体与该短链DNA杂交而结合在电极表面.带负电的DNA通过静电吸引结合电解液中的六氨合钌(RuHex)阳离子.当传感器和靶分子ATP孵育后,ATP与核酸适配体结合,使适配体链从电极表面解离,电极表面吸附的DNA量减少,结合RuHex的量随之降低.通过计时库仑技术检测RuHex响应信号降低的量 ,可以对ATP进行定量测定.此传感器的电化学响应信号与ATP浓度对数值呈线性关系,线性检测范围为0.001~100 μmol/L,检出限(S/N=3)为0.5 nmol/L.此传感器检测靶分子ATP后,可以通过简单的操作步骤再生,再生5次后的响应信号为初始信号的90%以上.采用此传感器检测大鼠脑透析液中ATP的含量为(19.2±3.7) nmol/L (n=3).     

基于多重氢键的寡聚芳酰胺自组装囊泡

六重氢键的异互补寡聚芳酰胺双股分子链在自组装过程中表现出极高的顺序专一性.本文借助扫描电镜(SEM)、透射电镜(TEM)和动态光散射(DLS)等实验手段,研究了氢键编码顺序为DADDAD-DADDAD的寡聚芳酰胺分子1及异互补分子2(ADAADA-ADAADA)存在下的自组装行为.实验结果表明,分子1在四氢呋喃/甲醇(体积比为85/15)和单一溶剂丙酮中都能组装成大小均匀的囊泡结构,并且囊泡的尺寸随着溶液浓度的增加而增大;当加入异互补分子2后,囊泡则转变成实心球.利用荧光显微镜,发现该囊泡能很好地包裹荧光分子(罗丹明B),通过进一步分子结构修饰有可能实现药物包埋和缓释方面的应用.     

基于分子信标的有机磷农药适配体活性位点分析及改造

设计了一个长度为20个核苷酸的分子信标,建立了有机磷农药和分子信标竞争结合适配体鉴定其活性的方法,对前期筛选的两条适配体进行了活性位点分析和改造.结果表明,分子信标设计合理,性能稳定,其发夹结构在室温下既可成功闭合也可成功打开,最佳的活性鉴定条件为分子信标与适配体添加比例1.25∶1,孵育时间50 min,孵育温度为室温.活性位点分析表明Loop2-4是4种有机磷农药共有的活性位点,Loop2-3及SS4-54适配体5’端和3 '端残余的核苷酸是甲拌磷重要的活性位点,Loop2-2和Loop4-2是丙溴磷和水胺硫磷共有的活性位点,Loop4-3是丙溴磷和氧化乐果共有的活性位点,Loop2-1和Loop4-1是水胺硫磷重要的活性位点.通过基因拼接改造的SS24-PJ-35适配体对丙溴磷和水胺硫磷的结合活性明显提高.     

基于核酸适配体的荧光法检测中药中赭曲霉素A

赭曲霉素A(OTA)是污染中药材的重要真菌毒素,严重影响中药材质量和用药安全.在小檗碱溶液中加入OTA和其核酸适配体后,处于随意卷曲状态的核酸适配体会被OTA诱导折叠成为G-四链体构象,使小檗碱的微环境发生改变,从而增强其荧光信号.基于此,本文以OTA核酸适配体为识别原件,小檗碱为荧光探针发展了一种无标记的荧光体系检测OTA.对主要影响因素,包括K+,Mg2,小檗碱和核酸适配体浓度进行了优化.在最佳实验条件下,小檗碱荧光信号变化值与OTA浓度在5～200 nmol/L范围内成正比,检出限5 nmol/L.该方法仅使用无标记的核酸适配体完成了OTA的检测,避免了对核酸适配体的繁琐设计和标记.方法 有较高的特异性,并成功应用于中药桔梗中OTA的检测,回收率在86.3％～105.6％之间.     

无标记电化学生物传感平台用于癌胚抗原的检测

基于目标物诱导DNA杂交链式反应(HCR)及银纳米颗粒(Ag NPs)自组装过程构建了无标记型电化学生物传感平台,并将其应用于癌胚抗原(CEA)的检测.在目标物存在的情况下,适配体对CEA进行特异性识别并结合,释放出与之互补的触发DNA链(t DNA).该t DNA能够被金电极上的捕获探针(c DNA)捕获,并启动HCR过程,使得两条发夹DNA链被相继打开并串联成长的DNA双链结构,带正电的Ag NPs通过与该DNA结构之间的静电作用大量自组装到电极表面,并产生强的电化学信号.在优化的实验条件下,该电化学生物传感平台能够在0.5 ng·L~(-1)到50μg·L~(-1)的浓度范围内实现对CEA的良好响应.     

基于二硫化钼/纳米金和硫堇/纳米金信号放大的雌二醇电化学适配体传感器

构建了一种新型的基于二硫化钼/纳米金和硫堇/纳米金信号放大的检测17β-雌二醇的电化学适配体传感器. 利用巯基自组装技术将17β-雌二醇的适配体探针DNA固定在二硫化钼/纳米金修饰玻碳电极表面, 与末端带巯基的部分互补DNA链杂交, 将硫堇/纳米金电化学指示剂自组装在杂交后的双链DNA上, 制备了17β-雌二醇电化学适配体传感器. 二硫化钼/纳米金复合材料增加了电极的有效表面积和DNA探针的固定量. 纳米金作为信号物质载体负载硫堇, 实现了电化学指示剂的信号放大. 加入目标物17β-雌二醇后, 目标物与适配体DNA特异性结合, 导致互补DNA链脱落, 双链上结合的硫堇/纳米金电化学指示剂数量减少, 电化学信号降低. 实验结果表明, 在1.0×10 ^-14~5.0×10 ^-12 mol/L范围内17β-雌二醇浓度与峰电流的线性关系良好, 检出限为4.2×10 ^-15 mol/L(S/N=3). 该传感器可望用于其它环境激素类物质的检测.     

基于分子信标末端现场标记三聚氰胺-Cu~(2+)电活性分子的高灵敏电化学传感器

本文构建了一种基于分子信标自由末端现场标记电活性信号分子的新型DNA传感器.首先将3′修饰巯基的分子信标通过Au–S键自组装到金电极表面,然后在修饰有羧基的5′自由末端通过共价偶合和配位作用依次组装上三聚氰胺(Mel)和铜离子(Cu2+),得到以Mel-Cu2+配合物为电活性信号源的分子信标.该方法简单实现了电活性分子信标的标记、分离和纯化.以[Fe(CN)6]3-/4-为电化学探针,采用循环伏安和电化学阻抗法对层层自组装过程进行了表征.杂交实验表明,Mel-Cu2+信号源所对应的峰电流强度随着杂交液浓度的增大逐渐降低,且氧化峰电流与互补序列浓度对数在1.0×10-15~1.0×10-9 mol/L范围内呈良好的线性关系.根据3σ计算得到检测限为2.4×10-16 mol/L.另外,由于分子信标特殊的茎环结构特征和Mel-Cu2+信号源稳定的无机配位组成,传感器显示了很高的特异性、再生性和稳定性.