野生大豆(Glycine soja SH1)球蛋白glycinin Gy4基因家族的两种表达拷贝

本文研究我国野生大豆(Glycine soja)种子贮藏蛋白基因的结构,并与栽培大豆进行比较,构建成野生大豆Glycine soja SH1和栽培大豆Glycine max子叶cDNA库。用已知含球蛋白glycinin Gy 4基因的克隆DNA λS 312为探针,从两个cDNA库中分离出6个克隆。其中两个克隆pWS 228与pWS 242含全长cDNA,克隆cDNA的限制酶图谱和cDNA与基因组DNA的Southern法杂交表明它们代表野生大豆球蛋白glycinin Gy 4基因家族的两种表达拷贝。pWS 228 cDNA的部分序列已测定并与栽培大豆相应顺序作比较。分子杂交还证明Ⅱ类glycinin基因家族的组编在野生大豆胚形成过程中的变动。     

反义人myc基因的表达对食管癌细胞恶性生长的抑制

本文构建了一个含有反义人c-myc基因片段(第三外显子及3’旁侧序列)的逆转录病毒载体——pDAM3.用磷酸钙沉淀法将pDAM3导入病毒包装细胞PA317,经过筛选获得病毒效价8×10~5CFU/ml的单克隆病毒包装细胞,DNA杂交分析证实病毒载体序列稳定地整合到PA317细胞中.利用DAM3病毒成功地感染了人食管癌细胞系EC8712,得到G418抗性细胞EC-DAM3,RNA杂交结果表明EC-DAM3细胞中存在着大量的反义mycRNA分子.EC-DAM3细胞的生长速率较之EC8712细胞下降50％,[~3H]胸腺嘧啶核苷掺入降低45％,细胞在裸鼠体内形成肿瘤的能力受到明显抑制.     

芜菁花叶病毒外壳蛋白基因的克隆及其植物表达载体的构建

从感病的萝卜叶片中得到芜菁花叶病毒(TuMV)的分离物,以oligo(dT)为引物,合成了其基因组RNA的互补DNA,并克隆到载体λ-ZAPⅡ中。通过单链cDNA探针杂交和DNA末端序列分析找出含有poly-A尾巴的阳性克隆。我们对一个含有1429个碱基插入片断的克隆进行了序列分析,根据芜菁花叶病毒外壳蛋白分子量的大小和马铃薯Y病毒组蛋白质加工位点氨基酸序列的保守性,确定了外壳蛋白基因的5′末端。利用PCR方法对其5′末端进行改造,加进起始密码ATG和两个限制性内切酶位点。通过基因重组操作,将该基因插入到双元载体pBI121的衍生物pBIN437中,得到芜菁花叶病毒外壳蛋白基因的植物表达载体。     

乙型肝炎病毒表面抗原互补脱氧核糖核酸的分子克隆及检定

用特异性免疫沉淀法从一人肝癌细胞株(PLC/PRF/5)中浓集乙型肝炎表面抗原(HBsAg)信使核糖核酸(mRNA),制得互补脱氧核糖核酸(cDNA),进行克隆.用已克隆化的病毒探针进行原位杂交,检得一个含HBsAg cDNA的菌株.对它进行了限制性内切酶谱及核苦酸序列分析.该 HBsAg cDNA经~(32)P标记后与PLC/PRF/5细胞DNA和RNA分别进行分子杂交的结果,显示出整合入该宿主基因组中乙型肝炎病毒的拷贝至少有6个;含HBsAg特异序列的PNA有三种、本文对乙型肝炎病毒在原发性肝癌致癌基因中可能的作用进行了讨论。     

冬小麦春化作用相关基因的cDNA分子克隆研究

以春化处理冬小麦幼苗cDNA为起始材料,通过与对照冬小麦幼苗mRNA进行减法杂交构建富集冬小麦低温诱导cDNA文库,以对照和脱春化幼苗cDNA及春化幼苗cDNA为探针,采用差异杂交技术筛选得到春化相关cDNA克隆,将插入片段用PCR方法扩增后亚克隆于pUC19载体的BamHⅠ和HindⅢ位点,用此插入cDNA作探针,与对照和春化组mRNA作Northern blotting分析表明为冬小麦春化作用相关基因的cDNA克隆,包含verc203序列的mRNA大约为2.6kb。     

C-myc反义RNA特异性诱发人食管癌细胞程序性死亡

本文报道以含有neo基因序列的逆转录病毒为载体,按1:1感染强度(细胞:病毒颗粒)向人食管癌细胞系EC8712中导入可持续产生互补于c-myc基因第二外显子及其两侧序列共1.53kb片段的反义RNA基因,得到G418抗性细胞。后者表型发生明显的改变,细胞生长抑制率为86.3％,c-Myc蛋白含量降低80％左右,而胎儿和成人食管上皮原代培养细胞的形态和生长速度没有明显改变。在1:10感染强度下,不经G418筛选,感染后12h行Southern blot(DNA)和Northern blot(RNA)分析,分别发现外源反义c-myc基因完整地整合到癌细胞基因组中并能有效表达,同时使内源性c-myc基因的表达降低了73.6％。病毒感染的瘤细胞在裸鼠体内形成肿瘤的能力明显下降。首次发现,反义c-myc RNA可抑制c-myc高表达的人食管癌细胞生长、诱导分化和程序性细胞死亡,同时,不损害或很少影响myc表达低的正常细胞。     

电化学石英晶体微天平实时表征和定量检测短序列DNA

利用电化学石英晶体微天平(EQCM)这一灵敏的质量和电化学传感器测定特定序列DNA。应用自组装膜技术在压电石英晶振表面自组装一带羧基的α－硫辛酸单层膜,通过盐酸1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)及N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)共价固化寡聚核苷酸为探针,用于测定与其碱基序列互补的DNA。实验中EQCM实时监测了α-硫辛酸的自组装过程、探针固化过程及其与cDNA杂交过程。定量得出了探针固化量及cDNA杂交量。在酸性、中性和碱性条件下,分别对固化和杂交过程进行表征,实验发现探针固化及DNA杂交都受pH影响,本文对此现象进行了解释。同时,利用染料Hoechst33258的电化学活性,使其与双链DNA嵌合,通过测量Hoechst33258的电化学信息进一步验证了DNA杂交关键步骤。     

CPS_1 cDNA克隆及大鼠肝癌癌变过程中CPS_1 mRNA量的变化

本研究以CPS_1mRNA为模板合成cDNA,与质粒pBR 322 DNA重组,经选择杂交法筛选获得GPS_1 cDNA克隆。以~(32)P标记cDNA作为探针与二乙基亚硝胺(DENA)诱发大鼠肝癌过程中不同病变肝中提取的总RNA及poly(A)~+RNA杂交。结果发现,CPS_1 mRNA的量随肝细胞癌变程度加深而递减,说明肝癌癌变过程中,CPS_1 基因表达的异常可能发生在转录水平。     

计时电量法用于检测急性早幼粒细胞白血病PML/RARα融合基因的研究

以氯化六氨合钌( [Ru (NH3)6]3+)为杂交指示剂,通过Au -S键的共价结合,将DNA探针固定在电极表面与互补靶序列杂交,构建了计时电量法(CC)检测急性早幼粒细胞白血病(APL)中PML/RARα融合基因的电化学DNA传感器,并通过对比杂交前后电量的变化检测互补序列及浓度.由于杂交前后与DNA链静电结合的[...     

马铃薯Y病毒基因组3′-端区域的克隆和序列分析

以马铃薯Y病毒(PVY,中国分离株)基因组RNA的cDNA为模板,我们用聚合酶连锁反应(PCR)合成了完整的外壳蛋白(CP)基因及部分3′末端非编码区序列。在5′-引物Y5中引入了限制性酶NcoI位点及起始密码AUG,3′-引物Y3中引入了Sall位点。PCR产物经NcoI及Sall双酶切后克隆入pGEM衍生质粒,并测定了其中一个克隆pPCY6的CP基因的序列,以此克隆的CP基因片段作探针,从cDNA库中钓出相关的几个克隆,并测定了序列,由此我们获得了包含部分NIb基因,全部的CP基因及3′-非编码区共1317个碱基。序列分析表明,该株系CP基因核苷酸序列与0株系同源性(94.2％)较与N株系(89.6％)同源性稍高,但氨基酸序列的同源性差别不大(分别为93.3％及91.8％)。目前我们已将该基因克隆入双元载体pBI121.1,并通过脓杆菌转化马铃薯,以期得到抗PVY的马铃薯工程株。