重金属铜胁迫苹果砧木根系的显微拉曼光谱诊断研究

重金属污染会影响农作物的正常生长,如何快速准确的实现对农作物中重金属的检测已成为亟待解决的问题之一。传统植物中重金属检测依赖于化学方法,虽然可以实现重金属含量的精准检测,然而其操作过程繁琐,并且无法实现批量样本的检测,更无法实现重金属胁迫下植物组织的原位微观检测。拉曼光谱具备无损探测固体、液体和气体状态的分子振动信息、光谱分辨率高和对水分不敏感等优势,因此利用拉曼光谱技术检测农作物中重金属含量具有可行性。苹果砧木是苹果树幼苗嫁接的基础,能够保障后期的苹果树体健康以及苹果果品品质与产量,而苹果砧木根系受到重金属污染,阻碍其健康生长并影响苹果树幼苗的抗逆性,因此探明重金属与苹果砧木根系互作机理十分必要。该研究以5组不同浓度CuSO₄·5H₂O溶液胁迫下的苹果砧木为研究对象,首先采集不同铜离子（Cu2+）胁迫梯度下苹果砧木根系的拉曼散射光谱,利用自适应迭代重加权惩罚最小二乘法（Air-PLS）和S-G平滑方法对所获得的拉曼光谱数据进行预处理,去除荧光影响以及进行基线校正;其次建立偏最小二乘判别分析（PLS-DA）模型和支持向量机（SVM）判别模型,结果表明：基于显微拉曼光谱和SVM,PLS-DA判别模型对苹果砧木根系的铜离子胁迫进行判别,SVM模型准确率可达100%,PLS-DA模型准确率为96%,能够较好的预测出苹果砧木受重金属铜的胁迫程度;最后基于特征拉曼光谱峰1 096,1 329,1 605和2 937 cm-1进行苹果砧木根系横截面的化学成像可视化研究。研究结果表明,拉曼光谱技术结合Air-PLS和S-G平滑建立的SVM模型和PLS-DA模型可以快速、有效地进行苹果砧木根系受重金属胁迫程度的诊断,为重金属胁迫农作物检测提供新的思路,对农作物的重金属逆境胁迫互作机理诊断具有理论指导意义。     

应用Hilbert变换提取拉曼光谱相位信息进行血液识别分类方法的研究

将拉曼光谱技术和化学计量学方法相结合实现了对人血和动物血种属的区分,并提出了一种基于Hilbert变换的拉曼光谱相位提取方法,提高了人血与动物血区分的准确度。分别对血液光谱数据和它所对应的相位信息进行主成分分析(PCA),通过主成分得分图比较两者对人与动物血液的区分程度,并建立偏最小二乘判别分析(PLS-DA)模型,通过设置合适的分类阈值y,可以实现人与动物血液的有效区分。结果表明在选取第一、第二主成分分析时,利用光谱数据相位信息建立的PCA模型,识别率更高,人与动物血液明显区分开来。其所对应的PLS-DA模型最优主成分数为3,预测标准误差(RMSEP)和决定系数(R2)分别为0.044 3和0.993 2。而用血液原始光谱建立的PLS-DA模型最优主成分数为6,RMSEP和R2分别为0.053 7和0.990 1。说明利用拉曼光谱相位信息建立的PLS-DA模型可以拟合较少的主成分数来获得误差更小的预测结果。进一步观察PLS-DA模型拟合不同主成分数的预测标准误差曲线图,当选取同样多的拟合主成分数时,利用血液拉曼光谱相位信息建立的PLS-DA模型其所对应的预测标准误差均低于原始血液光谱数据。所以,通过提取血液拉曼光谱数据的相位信息,可以降低模型的复杂程度,提高识别准确度。     

基于拉曼光谱和多元统计分析技术的结肠癌早期诊断

为了寻找结肠癌的病理发展规律在拉曼光谱属性上的体现,采用共聚焦显微拉曼光谱仪对60例离体的正常结肠组织、腺瘤性息肉和腺癌组织的近红外拉曼光谱进行对比检测,初步探讨了三类组织的拉曼光谱特征及其改变的规律。结果表明:三类组织拉曼光谱的差异明显存在于830,855,1 032,1 210,1 323,1 335,1 445,1 450,1 655 cm^-1处,腺瘤性息肉的光谱大体位于正常组织与腺癌组织之间。以组织病理诊断为金标准,主成分分析结合线性判别分析技术建立的诊断算法区分3类组织的灵敏度分别为96.9%、85.7%和97.3%,特异性分别为82.8%、90%和92.3%。因此,拉曼光谱有潜力在分子水平上区分正常结肠组织、腺瘤性息肉和腺癌组织,有望成为结肠癌早期诊断的一种有效方法。     

PLS-DA法判别分析木材生物腐朽的研究

利用近红外光谱结合PLS-DA判别分析方法可用于食品、药品和农产品等的快速识别或检测,因此,研究利用近红外光谱结合PLS-DA方法来检测木材的生物腐朽。研究结果表明：应用近红外光谱结合PLS-DA方法对培训集样本建立的判别模型,其校正及验证结果与实际分类变量的相关系数均超过0.94,SEC和SEP都低于0.17; 利用模型对未参与建模的样本进行检测,发现该模型对未腐朽、白腐和褐腐三种类型样本的判别准确率均为100%(偏差均小于0.5); 与SIMCA法相比,PLS-DA法对木材生物腐朽样本的判别准确率更高,说明应用近红外光谱结合PLS-DA方法能快速地检测到木材的生物腐朽,并能准确地判别出木材的生物腐朽类型。     

膀胱肿瘤离体组织的拉曼光谱学研究

使用激光共聚焦显微拉曼光谱仪测取膀胱肿瘤和正常膀胱组织的拉曼特征谱,应用主成分分析/支持向量机(principal component analysis,PCA/support vector machines,SVM)分类器对数据进行判别分析,最后使用弃一交叉验证法(leave-one-out cross validation,LOOCV)测试判别结果的准确度。结果发现膀胱肿瘤组织与正常膀胱组织的拉曼光谱存在明显差异,肿瘤组织在782和1 583cm-1等核酸特征谱带处峰高显著增强,而正常组织在1 061,1 295,2 849,2 881cm-1等蛋白质和脂质特征谱带处峰高显著增强。PCA/SVM可良好区分膀胱肿瘤组织和正常膀胱组织的拉曼光谱,LOOCV测试分类器显示肿瘤诊断的敏感度86.7%、特异度87.5%、阳性预测值92.9%、阴性预测值77.8%。由此得出结论:拉曼光谱可以良好诊断膀胱肿瘤的体外组织,展现了优越的临床应用前景。     

基于小波包能量熵和Fisher判别的油纸绝缘老化拉曼光谱诊断

准确诊断油纸绝缘材料的老化程度是保证油纸绝缘设备安全运行的重要技术手段。拉曼光谱在物质成分分析及状态诊断领域已经普遍应用。结合实验室搭建的油纸绝缘拉曼光谱分析平台，根据绝缘纸的平均聚合度将加速热老化实验获得的油纸样本分为四个老化阶段。通过对不同老化样本拉曼光谱所包含的能量信息分析，运用小波包能量熵提取特征量，结合Fisher判别法构造判别函数，建立基于拉曼光谱老化特征量的油纸绝缘老化诊断模型，并收集现场变压器油样验证诊断模型的泛化能力。结果表明，两个判别函数能区分不同老化阶段的绝缘油样，对于老化样本的判别正确率达到84.2%。拉曼光谱结合小波包能量熵和Fisher判别分析法能够有效地对油纸绝缘老化状态进行诊断。     

拉曼光谱技术在病理诊断中的研究进展

拉曼光谱技术能够提供与物质特定分子结构相关的光谱信息,可用于识别生物组织微小的生化变异,具有快速、实时、无损、无需样本预处理等优点,在临床病理诊断领域极具应用前景。与常规组织病理学分析相比,拉曼光谱技术能够直接检测活体组织,简化了分析程序,缩短了诊断时间。人体病变组织的细胞分子组成和结构可能发生变化,这为拉曼光谱技术在组织病理诊断中的应用提供了检测依据。基于组织分子组成与结构的差异,结合机器学习和化学计量学方法,拉曼光谱技术可以提供客观的诊断信息,实现快速、低侵入的病理诊断。回顾了近十年来拉曼光谱技术在组织病理诊断中的研究进展,对取得的关键成果进行了总结,阐述了当前离体和活体应用拉曼光谱技术的一些关键问题。针对离体拉曼光谱检测,重点评估福尔马林固定石蜡包埋样本、冷冻样本和新鲜组织样本等离体样本的适用情况;阐述拉曼光谱数据收集的关键技术,包括适用光源、光谱范围,以及病理样本光谱采集的方式等。对于活体拉曼光谱检测,重点介绍了活体检测研究中拉曼光谱技术应用的两种形式：结合医用内窥镜进行体内检测,以及开放手术中的直接检测;综述了临床适用的拉曼系统,重点介绍了当前活体拉曼研究中应用的光纤探头。同时,文章也讨论了拉曼光谱数据的处理与分析方法,通过光谱预处理,特征提取与分类识别,构建拉曼光谱病理诊断模型,在小样本范围能够获得较好的诊断结果。考虑临床实际应用,仍需要不断优化分析方法,实现拉曼光谱与生化信息的关联,将样本个体差异的影响纳入分类模型中,以提升模型性能。文章对拉曼光谱应用于病理诊断中的关键问题进行了讨论,为进一步开展研究提供参考。未来需要更深入和广泛地开展离体和活体研究,以促进拉曼光谱技术在临床中的应用。     

基于共焦显微拉曼的柑橘黄龙病无损检测研究

黄龙病危害柑橘果树日益严重,对柑橘黄龙病进行快速检测研究具有重大意义。采用拉曼光谱技术,结合偏最小二乘判别分析(PLS-DA)方法探讨快速诊断柑橘黄龙病及病情类别的可行性。获取柑橘叶片拉曼光谱并进行普通PCR鉴别分为轻度、中度、重度、缺素和正常5类。在715～1 639.5 cm-1范围内采用一阶导,基线校正(Baseline)和多项式拟合三种方法扣除光谱背景,突显叶片拉曼光谱特征峰。多项式拟合方法分别进行了2次,3次和4次拟合,与一阶导和基线校正两种扣除背景方法进行比较,结合最小二乘支持向量机(LS-SVM)和偏最小二乘判别分析(PLS-DA)建立判别模型。经比较发现,多项式拟合方法扣除光谱背景效果均好于另外两种方法,其中用2次多项式拟合的PLS-DA模型的效果最好,预测相关系数(R_P)为0.98,预测均方根误差(RMSEP)为0.67,总误判率最小为0。基线校正扣除光谱背景的LS-SVM模型效果最差,总误判率最大为40%。研究结果表明,利用拉曼光谱技术对柑橘黄龙病进行快速识别研究具有一定的可行性,为柑橘黄龙病无损检测研究提供一种新途径。     

KOPLS-DA在掺杂牛奶判别中的应用

运用核隐变量正交投影(kernel orthogonal projection to latent structure, KOPLS)方法,建立掺杂牛奶与纯牛奶的判别模型。分别配置含有三聚氰胺牛奶(0.01～3 g·L-1)和尿素牛奶(1～20 g·L-1)样品各40个,采集纯牛奶及掺杂牛奶样品的近红外光谱。选择4 200～4 800 cm-1为建模区间,采用KOPLS分别建立掺杂三聚氰胺、掺杂尿素、两种掺杂牛奶与纯牛奶的判别模型,并利用这些模型对未知样品进行判别。研究结果表明：与偏最小二乘判别(partial least squares discriminant analysis, PLS-DA)和隐变量正交投影判别(orthogonal projections to latent structures discriminant analysis, OPLS-DA)建模方法相比,KOPLS-DA具有更强的掺杂判别能力,对掺杂三聚氰胺、掺杂尿素牛奶和两种掺杂牛奶的判别正确率分别为95%,100%和97.5%。     

近红外激发荧光光谱与拉曼光谱快速鉴别马铃薯品种

马铃薯是世界上最重要的食物之一,快速无损的进行马铃薯品种鉴别对其在应用中更好的发挥品种优势具有重要作用。研究了以近红外荧光光谱和近红外拉曼光谱的土豆品种鉴别,并对两者进行了比较。实验采用3个品种共98个土豆样本,随机将其分成校正集(74个)和预测集(24个)。首先使用785nm近红外激光激发,采集所有样本的荧光和拉曼混合光谱,然后从混合光谱中分别提取荧光光谱和拉曼光谱,最后对荧光光谱和拉曼光谱进行偏最小二乘判别分析(PLS-DA),PLS-DA模型采用留一法和全交互验证。结果显示,荧光光谱与拉曼光谱都能够对三个马铃薯品种进行鉴别,其中荧光光谱的PLS-DA模型预测Favorita品种效果较好(灵敏度为1,特异性0.86,准确性0.92),但Diamant品种(灵敏度为0.75,特异性0.75,准确性0.75)和Granola品种(灵敏度为0.16,特异性0.89,准确性0.71)预测的效果较差,而拉曼光谱图很好的解释了马铃薯中的主要营养成分,基于拉曼光谱的PLSDA模型的预测效果(三个品种预测灵敏度,特异性,准确性均为1)比荧光光谱判别效果显著提高。     

Raman Spectroscopy Can Detect and Monitor Cancer at Cellular Level: Analysis of Resistant and Sensitive Subtypes of Testicular Cancer Cell Lines

Abstract: Raman spectroscopy has been applied to analyze testicular cancer cell lines. Spectral differences between resistant and sensitive subtypes of testicular cancer cell line 833k samples were successfully analysed. The technique allowed reproducible and quantitative analysis of the specimen and illustrated the chemical specifications of the samples precisely. Six pairs of testicular cancer cell line 833k were studied and the findings were backed by statistical methods; that is, partial least squares discriminant analysis (PLS-DA).

It was concluded that Raman spectroscopy can objectively differentiate between resistant and sensitive cell lines. These results suggest that in the future it may be possible to use cell lines and diagnostic Raman spectroscopy for preoperative classification of biological molecules. Further research is underway to determine whether results obtained from spectroscopic analysis of cell lines can be applied to actual human tissue samples.     

Study of both fingerprint and high wavenumber Raman spectroscopy of pathological nasopharyngeal tissues

High wavenumber (HW) Raman spectroscopy has weaker fluorescence background compared with fingerprint (FP) region. This study aims to evaluate the discrimination feasibility of nasopharyngeal non‐cancerous and nasopharyngeal cancer (NPC) tissue with both FP and HW Raman spectroscopy. HW Raman spectra of nasopharyngeal tissue were obtained for the first time. Raman spectra were collected to differentiate nasopharyngeal non‐cancerous (n = 37) from NPC (n = 41) tissues in FP (800–1800cm⁻¹), HW (2700–3100cm⁻¹), and integrated FP/HW region. First, to assess the utility of this method, the averaged Raman spectral intensities and intensity ratios of corresponding Raman bands were analyzed in HW and FP regions, respectively. The results show that intensities as well as the ratios of specific Raman peaks might be helpful in distinguishing nasopharyngeal non‐cancerous from NPC tissue with the HW Raman spectroscopy, as with FP Raman reported before. The multivariate statistical method based on the combination of principal component analysis–liner discriminant analysis (PCA‐LDA), together with leave‐one‐patient‐out, cross‐validation diagnostic algorithm, was used for discriminating nasopharyngeal non‐cancerous from NPC tissue, generating sensitivities of 87.8%, 85.4%, and 95.1% and specificities of 86.5%, 91.9%, and 89.2%, respectively, with Raman spectroscopy in the FP, HW, and integrated FP/HW regions. The posterior probability of classification results and receiver operating characteristic curves were utilized to evaluate the discrimination of PCA‐LDA algorithm, verifying that HW Raman spectroscopy has a positive effect on the differentiation for the diagnosis of NPC tissue by integrated FP/HW Raman spectroscopy. What's more, the potential of Raman spectroscopy used for differentiating different pathology NPC tissues was also discussed. The results demonstrate that both FP and HW Raman spectroscopy have the potential for diagnosis and detection in early nasopharyngeal carcinoma, and HW Raman spectroscopy may improve the discrimination of NPC tissue compared with FP region alone, providing a promising diagnostic tool for the diagnosis of NPC tissue. Copyright © 2015 John Wiley & Sons, Ltd.     

Diagnosis of colorectal cancer using Raman spectroscopy of laser-trapped single living epithelial cells

A single-cell diagnostic technique for epithelial cancers is developed by utilizing laser trapping and Raman spectroscopy to differentiate cancerous and normal epithelial cells. Single-cell suspensions were prepared from surgically removed human colorectal tissues following standard primary culture protocols and examined in a near-infrared laser-trapping Raman spectroscopy system, where living epithelial cells were investigated one by one. A diagnostic model was built on the spectral data obtained from 8 patients and validated by the data from 2 new patients. Our technique has potential applications from epithelial cancer diagnosis to the study of cell dynamics of carcinogenesis.     

基于中红外光谱技术鉴别转基因大豆的方法研究

转基因技术对于实现粮食增产,保护生物多样性,减少化学农药使用量等方面有着重大意义,但也可能存在一定的安全隐患。因此,转基因作物检测鉴别技术的研究愈发受到重视。本文采用中红外光谱分析技术,研究对不同品种的转基因大豆及其亲本进行鉴别的可行性。实验采集了三种不同的非转基因大豆亲本(HC6, JACK和W82)及其转基因大豆品种在3 818～734 cm-1范围内的光谱信息。采用偏最小二乘-判别分析(partial least squares-discriminant analysis, PLS-DA)进行判别分析,三种大豆的建模集的判别正确率分别为96.67%, 96.67%和83.33%,预测集的判别正确率分别为83.33%, 85%和85%。研究中采用X-loading weights、变量投影重要性(variable importance in the projection,VIP)和二阶导数(second derivative,2-Der)三种特征波数选择方法对光谱数据进行处理,并根据得到的特征波数分别建立PLS-DA模型进行判别分析,三种大豆的建模集和预测集的判别正确率均超过76.67%和75%。采用主成分分析(principal component analysis,PCA)和独立组分分析(independent component analysis,ICA)两种特征信息提取方法对光谱数据进行处理,分别建立PCA-PLS-DA和ICA-PLS-DA模型进行判别分析,三种大豆的建模集和预测集的判别正确率均超过80%和75%。研究表明中红外光谱分析技术可以较为准确地鉴别非转基因亲本与转基因品种,为转基因大豆的无损鉴别提供新的思路。同时结合特征波数选择方法与特征信息提取方法可以有效地降低模型复杂度,减少程序运算量。     

FTIR结合化学计量学对三七产地鉴别及皂苷含量预测研究

不同产地对中药次生代谢产物有显著影响,产地鉴别有助于中药的科学合理利用;其次,有效成分含量检测是评价中药质量的主要手段。通过傅里叶变换红外光谱结合化学计量学建立快速鉴别三七产地及测定三七中四种主要皂苷的方法,为三七的科学、合理、规范使用以及对三七质量进行快速评价提供依据。采集5个区域12个产地117个三七样本的红外光谱。产地鉴别预处理数据采用离散小波变换除去噪音造成的部分高频信号,偏最小二乘判别对产地判别贡献率大于1的数据进行筛选,kennard-stone算法将117个个体分为70%训练集与30%预测集。训练集数据用于建立支持向量机判别模型,交叉验证法用于筛选支持向量机最优参数,预测集数据对支持向量机判别模型结果进行验证。皂苷含量预测预处理数据采用标准正态变量变换、离散小波变换处理;处理的红外数据设为X变量,三七样品中通过高效液相色谱法测得的四种皂苷总量设为Y变量,采用正交信号校正去除红外光谱中与四种皂苷总量无关的干扰数据。个体数据分为80%训练集与20%预测集,训练集建立偏最小二乘回归模型,预测集数据对偏最小二乘回归模型的预测结果进行验证。结果显示： (1)交叉验证法得到支持向量机判别模型的最优参数为c=2.828 43,g=0.062 5,训练集的产地判别最优正确率为91.463 4%;(2)支持向量机判别模型参数设置为最优参数,代入预测集数据,预测集的产地判别正确率为94.285 7%,判别正确率较高;(3)训练集建立偏最小二乘回归模型的相关系数R2=0.941 8,校正均方差RMSEE=4.530 7;(4)代入预测集数据,预测集的相关系数R2=0.962 3,外部检验均方差RMSEP=3.855 9,皂苷预测值与高效液相检测值接近,预测效果良好。傅里叶变换红外光谱结合支持向量机能对三七进行产地鉴别,正交信号校正结合偏最小二乘回归能对三七中四种主要皂苷总量进行准确预测,为三七质量控制提供一种快速简便、无损、高灵敏度的检测方法。     

人体不同组织的拉曼光谱研究

测试了人体甲状腺、卵巢、输卵管、肺、子宫平滑肌、子宫颈等组织的拉曼光谱。结果显示,用氩离子激光514.5 nm激发,人体组织拉曼光谱的荧光背景强,在500～3 500 cm-1范围,肺和宫颈组织未显示特征带,甲状腺和子宫组织则显示了较多的带。在600～1800 cm-1范围,子宫、输卵管组织只显示了类胡萝卜素的拉曼带。正常甲状腺组织的光谱和甲状腺滤泡癌组织的光谱之间显示出明显差异,后者没有呈现1 585和1 634 cm-1特征带;正常肺组织与肺癌组织的拉曼光谱也有较大区别,肺癌组织的光谱强度比正常组织的低得多。拉曼光谱技术在临床医学诊断方面将会发挥重要的作用。     

人胚胎干细胞与急性早幼粒细胞白血病细胞的拉曼光谱特征研究

急性早幼粒细胞白血病(APL)属于急性髓系白血病(AML),是FAB分型中的M3亚型。部分APL患者形成早幼粒细胞白血病/维甲酸受体融合基因,即PML-RARα融合基因。在内外界多种因素的共同作用下,早幼粒细胞白血病发病。胚胎干细胞(ESCs)具有多向分化的能力,在一定诱导条件下, ESCs可以向造血系统分化。早幼粒细胞位于ESCs分化下游,为粒系分化阶段的一种细胞。探索一种非标记的技术方法鉴别不同分化阶段造血细胞具有重要的科研和实践意义。拉曼光谱技术可用于多种类型疾病的鉴别诊断研究,近年来应用前景愈加广阔。实验研究人胚胎干细胞系(ES)、急性早幼粒细胞白血病细胞系(NB4)和急性早幼粒细胞白血病患者(M3)白血病细胞的拉曼光谱特征,建立拉曼光谱非标记鉴别不同分化阶段白血病的方法,为临床实验研究提供基础。分别收集胚胎干细胞系(ES)、急性早幼粒细胞白血病细胞系(NB4)和4例M3患者白血病细胞,使用Horiba Xplora拉曼光谱仪获取拉曼光谱,每组或每例患者采集25~30个白血病细胞光谱。结合应用主成分分析法(PCA)、判别函数分析(DFA)、系统聚类分析和偏最小二乘判别分析(PLS-DA),对三类细胞的光谱进行分析并建立模型,进而对三类细胞进行鉴别,应用交互验证法对模型进行验证。同时结合细胞超微结构分析三种细胞的拉曼光谱特征。M3, NB4和ES细胞的拉曼光谱差别显著,主要表现为M3和NB4细胞光谱中对应核酸、蛋白质及脂类物质的谱峰明显高于ES细胞,其生物学机制包含了APL与PI3K/Akt/mTOR通路的密切关系。PI3K/Akt/mTOR通路在急性早幼粒细胞白血病细胞中存在异常激活,影响白血病细胞的生物大分子代谢;鉴别建模的总体分类准确率达100%(181/181),交互验证的分类准确率达98.9%(179/181),表明鉴别模型预测能力良好。拉曼光谱分析显示M3细胞和NB4细胞增殖代谢明显高于ES细胞,根据PCA-DFA、聚类分析及PLS-DA建立的拉曼光谱鉴别模型能够准确区分3种不同分化阶段白血病相关细胞,其结果与电镜结果相符。     

Raman Spectroscopy of Biological Tissues

Abstract

We previously published a comprehensive review paper reviewing the Raman spectroscopy of biological molecules. This research area has expanded rapidly, which warranted an update to the existing review paper by adding the recently reported studies in literature. This article reviews some of the recent advances of Raman spectroscopy in relation to biomedical applications starting from natural tissues to cancer biology. Raman spectroscopy, an optical molecular detective, is a vibrational spectroscopic technique that has potential not only in cancer diagnosis but also in understanding progression of the disease. This article summarizes some of the most widely observed peak frequencies and their assignments. The aim of this review is to develop a database of molecular fingerprints, which will facilitate researchers in identifying the chemical structure of the biological tissues including most of the significant peaks reported both in the normal and cancerous tissues. It has covered a variety of Raman approaches and its quantitative and qualitative biochemical information. In addition, it covers the use of Raman spectroscopy to analyse a variety of different malignancies including breast, brain, cervical, gastrointestinal, lung, oral, and skin cancer. Multivariate analysis approaches used in these studies have also been covered.