人卵透明带3基因片断hZ3.3的克隆及其在毕赤酵母中的表达

为了探讨透明带与精子的作用机制,人卵透明带3(human Zona Pellucida 3,hZP3)第19l位氨基酸到319位氨基酸之间的cDNA序列通过PCR方法扩增后,克隆到表达载体pPICZαA上,构建成重组质粒pPICZαA-hZ3．3。该质粒经SacⅠ线性化后电打孔转入Pichia pastoris酵母X-33中,用YPDS Zeocin^ 筛选高拷贝转化子,并用PCR分析鉴定目的基因片断与酵母基因组的整合,阳性转化子用0．5％甲醇诱导,表达目的蛋白。经SDS-PAGE凝胶电泳和Western-blot鉴定分析,结果表明目的基因成功表达,表达产物大小约为37kD。     

HPV16-E7在Pichia Pastoiris酵母中的分泌表达

本研究利用酵母Pichia pastoris真核表达系统表达人乳头瘤病毒16(HPVl6)E7蛋白，试图解决新疆维吾尔妇女高发宫颈癌的诊断、疫苗的研究中抗原蛋白需要的问题。依据新疆维吾尔妇女宫颈癌组织克隆获得的HPVl6—E7基因序列设计引物，并分别在5’引物和3’引物中引入了EcoR I和Xba I酵切位点，经RCR扩增后连接到pMDl8—T载体上，再将HPVl6—E7克隆至穿梭质粒pGAPZαA上，获得的重组穿梭质粒pGAPZαA—E7经线性化后，采用UiCl法将重组穿梭质粒转入酵母细胞内，Zeocin 筛选阳性克隆，经小瓶发酵后，取上清作SDS-PAGE，并做Western印迹检测表达的蛋白质，结果表明HPVl6-E7成功地在酵母真核表达系统获得表达，表达产物的分子量分别是22KDa和88KDa，为深入开展HPVl6-E7蛋白功能和应用的研究奠定了理论基础。     

黑曲霉脂肪酶基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达

根据黑曲霉F044脂肪酶N-端氨基酸序列，运用生物信息学方法，找到与黑曲霉脂肪酶基因同源的候选基因A84689．根据该基因序列，设计引物直接经RT—PCR扩增得到黑曲霉脂肪酶全长基因anl．anl全长1044bp，含3个内含子，编码297个氨基酸（含信号肽27个氨基酸），与其他脂肪酶基因没有明显的同源性．将成熟脂肪酶基因连接到pPIC9K载体上得到重组表达质粒，转化P．pastoris GSll5．脂肪酶基因在P．pastoris GSll5中实现了分泌性表达．     

重组真核表达载体pEGFP—C1／cecropin—XJ的构建及其在胃癌细胞MGC80—3中的表达

目的构建新疆家蚕抗菌肽（cecropin—XJ）基因的真核表达载体pEGFP—C1／cecropin—XJ（pEGFP—cec），检测其在肿瘤细胞中的表达情况，探讨抗菌肽对肿瘤细胞的作用机制和抗菌肽抑瘤作用效果．方法应用基因重组技术，将新疆家蚕抗菌肽（cecropin—XJ）基因克隆到真核表达载体pEGFP—C1，通过酶切和测序的方法鉴定重组质粒pEGFP—cec的正确性．将pEGFP—cec经脂质体法转染到胃癌细胞MGc80—3，48h后观察EGFP瞬时表达情况；72h后，应用RT—PCR，检测抗菌肽cecropin—XJ基因的表达；96h后，消化细胞，经台盼蓝染色，检测重组质粒pEGFP—cec表达产物对肿瘤细胞的影响．结果细胞转染48h后，荧光显微镜下可观察到EGFP的表达，发出绿色荧光；转染72h后，RT—PCR检测到胞内有抗菌肽cecropin—XJ基因的表达；表达产物能够抑制肿瘤细胞的生长．结论成功构建了真核表达载体pEGFP—cec，并在肿瘤细胞中可见抗菌肽cecropin—XJ和EGFP基因的有效表达以及表达产物具有显著的抗肿瘤活性．为深入开展抗菌肽抑制肿瘤的研究奠定基础．     

蝎神经毒素AaIT的表达及功能分析

在不改变氨基酸编码序列的情况下，根据大肠杆菌密码子偏爱性，设计并人工合成了适合于大肠杆菌表达的蝎神经毒素AaIT基因．将该基因插入到大肠杆菌表达载体PET32a＋中，得到重组质粒PET32a-AaIT，将该质粒转入带有trxB／gor双突变的大肠杆菌Origami（DE3），重组菌株经IPTG诱导后，获得町溶性表达产物，但该表达产物没有生物学活性．把此基因插入到含有AOX1启动子和α分泌信号肽序列的毕赤酵母表达载体pPIC6αA构建重组质粒pPIC6αA-AalT，转化毕赤酵母（X-33），经甲醇诱导后，获得高水平的分泌表达（20mg／L）．表达产物喂食银纹夜蛾及甜菜夜蛾没有表现出生物活性，经注射有活性．     

人白细胞介素10(hIL10)在毕赤酵母中的表达

利用PCR技术从质粒pcDNA3．1／GS扩增得到hIL10基因．将其插入含有AOX1启动子和α分泌信号肽序列的毕赤酵母表达载体pPIC9K中，构建重组质粒pPIC9K／IL10，转化毕赤酵母GS115，筛选出整合了多拷贝白细胞介素10基因的菌株，经摇瓶培养，0．5％甲醇诱导表达、SDS-PAGE分析显示，表达产物以可溶性分子形式存在于上清中，诱导4d的表达量达到高峰．Western印迹表明．表达产物具有良好的抗原性和特异性．     

人γ干扰素/β肿瘤坏死因子融合蛋白His6融合表达及一步纯化

将人γ干扰素 /β肿瘤坏死因子融合蛋白 ( hγTNF-β)重组基因克隆于表达载体 p ET2 8,构建成T7lac启动子控制下的 His6融合表达质粒 ,转化溶源菌 E.coli BL 2 1 ( DE3 ) .经 IPTG( 1 m M)诱导表达 ,阳性菌在 SDS-PAGE泳图上出现一条粗表达带 ,其分子量 ( 3 2 k Da)与目的蛋白 His6-γ TNF-β)理论分子量相符 .薄层扫描与溶解性分析显示 ,表达产物占菌体总蛋白的 4 5%以上 ,主要为不溶性的包涵体( IBs) .离心分离 IBs产物 ,溶于 7M尿素中 ,然后通过 Ni柱进行亲和层析 ,即可获得一步纯化的表达产物(纯度为 96%、回收率为 91 % ) .纯化产物再经复性缓冲液稀释复性 ,其细胞毒比活性与抗病毒比活性分别达到 1 .2× 1 0 7～ 2 .0× 1 0 7u/m gp和 6.6× 1 0 5～ 7.2× 1 0 5u/mgp     

人γ干扰素 /β 肿瘤坏死因子融合蛋白 His6融合表达及一步纯化

将人 V干扰素 /U肿瘤坏死因子融合蛋白 (hVTNF-U )重组基因克隆于表达载体 pET28,构建成 T7 lac启动子控制下的 His6融合表达质粒 ,转化溶源菌 E. coli BL21( DE3).经 IPTG(1mM )诱导表达 , 阳性菌在 SDS-PAGE泳图上出现一条粗表达带 ,其分子量 (32kDa) 与目的蛋白 H is6-V TN F-U ) 理论分 子量相符. 薄层扫描与溶解性分析显示 ,表达产物占菌体总蛋白的 45% 以上 ,主要为不溶性的包涵体 ( IBs).离心分离 IBs产物 ,溶于 7M尿素中 ,然后通过 Ni柱进行亲和层析 ,即可获得一步纯化的表达产物 (纯度为 96%、回收率为 91% ).纯化产物再经复性缓冲液稀释复性 ,其细胞毒比活性与抗病毒比活性分 别达到 1. 2× 10 7～ 2. 0× 107u /mgp和 6. 6× 10 5 ～ 7. 2× 105 u/mgp.     

葡萄球菌肠毒素B基因原核表达系统的构建及其表达产物促淋巴细胞增殖和抑制肿瘤细胞生长作用的研究

构建葡萄球菌肠毒素B（staphylococcal enterotoxins B,SEB）基因原核表达系统,了解重组表达产物rSEB促淋巴细胞增殖和抑制肿瘤生长的作用．采用高保真PCR从金黄色葡萄球菌FRIS6B株DNA中扩增全长SEB基因片段,T—A克隆后测序,构建SEB基因原核表达系统pET32α-SEB—E．coliBL2IDE3．采用SDS-PAGE检测rSEB表达产量,Ni—NTA亲和层析法提纯rSEB．采用TCID50法测定rSEB对Vero细胞的细胞毒性作用并计算TCID50值．采用MTT比色法分别检测不同浓度rSEB体外对小鼠脾细胞、人外周血单个核细胞（PBMC）的促增殖作用以及对HepG2细胞（人肝腺癌细胞）、HeLa细胞（人宫颈癌上皮细胞）的生长抑制作用．与公布的相关序列比较,所克隆的SEB基因核苷酸序列相似性为100％．rSEB表达量约为细菌总蛋白的40％．rSEB对Vero细胞的TCIC50为3．02μg．5．0～20．0μg／ml的rSEB对小鼠脾细胞和人PBMC均有明显的促增殖作用（P〈0．05）．5．0～20．0μg／ml rSEB作用的人PBMC上清均能有效地抑制HepG2细胞和HeLa细胞生长（P〈0．05）．本研究成功地构建了rSEB高效原核表达系统．rSEB仍然具有生物学活性．所建立的细胞毒性、促淋巴细胞增殖和抑制肿瘤细胞生长作用的检测方法,为以后减毒rSEB突变体的筛选奠定了基础．     

纳豆激酶原核表达纯化及多克隆抗体的制备

纳豆激酶是一种源于日本传统食品纳豆且具有强烈溶栓作用的丝氨酸蛋白酶．本研究将编码信号肽、前导肽和成熟肽在内的纳豆激酶基因克隆到原核表达载体pET28a^＋中,获得重组表达质粒pETNK．将此重组表达载体质粒转化到大肠杆菌BL21中,经IPTG诱导表达．SDS-PAGE结果显示纳豆激酶在大肠杆菌中成功表达,表达的纳豆激酶融合蛋白分子量大约为31kD．亲和层析法纯化表达产物,并以此纯化产物作为免疫原免疫新西兰大白兔,制备兔抗纳豆激酶血清,用ELISA和Western blotting对制备的兔抗血清中的多克隆抗体进行了鉴定．纤维蛋白平板实验显示,表达的纳豆激酶融合蛋白具有较好的溶纤活性．